种特异巢式 PCR

种特异巢式 PCR 是针对种特异的基因设计引物，能够区分同一属内不同种的微生物。

种特异巢式 PCR 的基本原理是：在种特异 PCR 中，扩增基因一般选择在较为保守的 16S rRNA 和 23S rRNA 内。微生物在其分类中有严格的分类方法，例如门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)， 种是生物分类中基本的分类单元和分类等级。属于同一种的微生物在进化中形成了一部分保守的基因序列。因此可用 PCR 扩增其相应的 rDNA 片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌。

种特异巢式 PCR 的常用应用领域如下：细菌鉴定和分类。

器材：PCR 扩增仪、电泳仪

试剂：

① 模板： 基因组 DNA 或 cDNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物： 两条外引物，两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液

⑤ 高压灭菌去离子水

种特异巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）模板

利用基因组提取试剂盒提取临床标本或者培养物中的基因组 DNA， DNA 重悬于无菌水中，定量为 1 μg/ml。

（二）引物设计

通常在同一种内的微生物，16 S rDNA、23 S rDNA 序列都较为保守，因此在种特异巢式 PCR 中，扩增的目的片段通常选择在这些序列中，也可选择其它较为保守的序列。通过进化树分析，选择那些种内保守而又能够区分不同种的序列来设计引物。扩增片段大小没有固定的要求，通常在引物中不设计简并碱基。引物设计原则同常规 PCR。外引物可以针对同一属的保守序列，而内引物可以针对种特异的序列保守区，从而通过种特异 PCR 区分同一属内的不同种微生物。

（三）种特异巢式 PCR 反应

A. PCR 反应体系：

设立 50 pl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

DNA 或 cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 （P1、P2） 各 1 μl

H₂O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油 （约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

B. 设置 PCR 反应条件：

预变性 94 ℃，3 min

变性 94 ℃，30 s

退火 55 ℃，30 s 30 个循环

延伸 72 ℃，60 s

延伸 72 ℃，7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

C. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

第一轮 PCR 产物 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的正反向内引物 （P3 ，P4） 各 1 μl

H₂O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮。

D. PCR 产物的检测

反应结束后，用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

在引物的设计方面需要进行严格分析。由于 16 S rDNA 序列在原核生物中的高度保守性，对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差。23 S rRNA 分子比较大（约 3 kb）， 并且只有少数种的核酸序列被报道，尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用。16 S~23 S rDNA 区间（intergenic spacer region， ISR）由于没有特定功能和进化速率，比 16S rDNA 大 10 多倍，近几年来在细菌鉴定和分类方面备受关注。一些细菌的 16 S~23 S rDNA ISR 的数目、大小和序列已经报道，它们之间的不同使其在细菌系统发育学，特别是相近种和菌株的区分和鉴定方面占据了一席之地。因此要根据实验要求选择不同的保守区设计引物。