巢式 PCR－限制性片段长度多态性

巢式 PCR－RFLP(nested PCR－RFLP)是将限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism,RFLP) 与巢式 PCR 技术相结合，通过设计高度 保守序列的引物对待检物种 DNA 进行 PCR 扩增，对 PCR 产物进行 RFLP 分析。

巢式 PCR－限制性片段长度多态性的基本原理是：根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位 点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这 种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体） 的 DNA 水平的差异（即 多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种 基因组 DNA 的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(mark)构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记 连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基 因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组 DNA 后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。

巢式 PCR－限制性片段长度多态性的常用应用领域如下：流行病学调查和临床常规检测。

器材：PCR 扩增仪、电泳仪

试剂：

① 模板： 基因组 DNA 或 cDNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物： 两条外引物，两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶

⑤ 高压灭菌去离子水

⑥ 限制性内切酶及其 10× 缓冲液

巢式 PCR－限制性片段长度多态性的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同。通常内引物与外引物的间隔距离也没有统一的 要求，具体情况根据每个实验而定。

（二）巢式 PCR 反应

A. PCR 反应体系：

设立 50 pl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

DNA 或 cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 （P1、P2） 各 1 μl

H₂O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油 （约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

B. 设置 PCR 反应条件：

预变性 94 ℃，3 min

变性 94 ℃，30 s

退火 55 ℃，30 s 30 个循环

延伸 72 ℃，60 s

延伸 72 ℃，7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

C. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

第一轮 PCR 产物 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的内引物 （P3 ，P4） 各 1 μl

H2O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮。

D. PCR 产物的检测

反应结束后，用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

（三）PCR 产物酶切

当获得第二轮的 PCR 产物后，选用适当的限制性内切酶，酶切位点的选择要根据已有序列的分析，酶切的反应体系为 20 μl。

10× 内切酶缓冲液 2 μl

第二轮 PCR 反应的产物 10 μl

限制性内切酶 10 U

H₂O 至 20 μl

37 °C 水浴 5 h。

（四）酶切产物的检测

获得酶切产物后，要根据目的片段的大小选择不同的琼脂糖浓度。因酶切产生的片段能小于 100 bp，所以用琼脂糖浓度应当比平时高一些，例如 2％～5％，如果酶切产生的片段大部分小于 500 bp，可用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。如果酶切产物的浓度较低，可用杂交的方式来增加灵敏度。

扩增的基因要选择适合进行 RFLP 分析的区域，尽量选择常用的限制性内切酶，分型位点不能过于接近。有时出现一些稀有酶的酶切位点，会导致酶切效率下降或费用昂贵。未酶切的 DNA 要防止发生降解，酶切反应一定要彻底。