🔥 普通数字 PCR

数字 PCR 即 Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于 qPCR，数字 PCR 可让你能够直接数出 DNA 分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

数字 PCR 的基本原理是将分析样品 DNA 被稀释成大约平均每两个孔含有一个样本分子，然后平分到多孔板中。在最佳条件下利用 PCR 扩增单个拷贝的模板。

扩增产物和分子信标（molecular beacon, MB）荧光探针进行杂交，并根据不同的荧光来检测序列特异的 PCR 产物。数字 PCR 直接计算两两相比样本中的每个样品等位基因的数量（例如，父系来源样本相对母系来源样本，或者是野生型相对突变型）。

同时，可利用统计学分析方法来分析两个样品差异的可靠性，例如贝叶斯似然方法（Bayesian-type likelihood methods）。

分子信标探针工作原理：M 是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核甘酸探针，它的 5' 端连接有荧光基团，3' 端连接有猝灭基团（Dabcyl基团），两端的核酸序列互补配对，因此 3' 端的猝灭基团和 5' 端的荧光基团紧紧靠近，荧光基团被激发后产生的光子被猝灭基团猝灭。

当 MB 引物和模板配对时，MB 引物的 5' 端和 3' 端将被分开，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团和猝灭基团分开，猝灭作用被解除。当荧光基团被激发时产生能量，以红外光波形式释放出来。

器材：

PCR仪、离心机、荧光分光光度计或双通道荧光定量PCR仪、紫外分光光度计。

试剂：

(1) 缓冲液和溶液: 67 mmol/L Tris (pH 8.8)，

16.6 mmol/L (NH4)₂SO₄，6.7 mmol/L MgCl₂，

10 mmol/Lβ-巯基乙醇，20 mmol/L dATP，20 mmol/L dCTP，20 mmol/L dGTP，20 mmol/L dTTP，6% DMSO。
(2) 酶Taq聚合酶；
(3) 核酸和寡核苷酸：
① 外源或目的DNA；
② 引物和探针: 1 μmol/L 引物 F1，1 μmol/L 引物 R1，5 μmol/L 引物 INT，1 μmol/L 绿色荧光分子信标（MB-green），1 μmol/L 红色荧光分子信标（MB-red），引物均溶于 50 μmol/L TE缓冲液中。

数字PCR的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

引物 F1 和引物 R1 是用于扩增目的片段的两段特异引物；引物 INT 是用于在 PCR 扩增中产生单链目的片段；MB-red 是一段 MB 探针，用于检测目的片段之外的基因组上的任一片段的 PCR 产物，包括野生型和突变型；MB-green 是一段 MB 探针，用于检测野生型目的片段的 PCR 产物。

扩增目的片段内的突变能显著阻止 PCR 产物与 MB-green 探针 的杂交，通过比较 MB-green/MB-red 的荧光信号强度可以知道野生型 DNA 占总样本的比例，从而知道突变型DNA占总样本的比例。

（二）PCR 扩增反应

A. 将从组织或者体液中提取的基因组 DNA 样品梯度稀释，然后加入到 96 孔 PCR 板中，大约每个孔中含有 0.5 个基因组 DNA。

注意：稀释后的 DNA 样品需要使用常规 PCR 反应进行检测，以确定每孔中加入约 0.5 个基因组 DNA。每个孔模板量约为 1.5 pg，即定义为每个孔中含有 0.5 个模板分子。

B. 按以下各成分配成工作液 700 μl，然后在 96 孔 PCR 板的每孔中加入 7 μl 工作液，混匀后进行 PCR 反应。

PCR工作液配比：
10× 扩增缓冲液 70 μl
20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH8.0） 35 μl
20 μmol/L 正向引物 F1 35 μl
20 μmol/L 反向引物 R1 35 μl
1~5 U/μl Platinum○RTaq DNA 聚合酶 35 U
H₂O 490-518 μl
总体积 700 μl

标准 PCR 反应条件:

试剂 浓度
MgCl2 6.7 mmol/L
Tris(pH 8.8) 67 mmol/L
(NH4)2SO4 16.6 mmol/L
β-巯基乙醇 10 mmol/L
dNTPs 1 mmol/L
DMSO 6%（体积分数）
引物 1 μmol/L
Platinum○RTaq DNA聚合酶 0.05 U/μL
模板DNA 0.5个分子

C. 在反应混合液的上层加一滴透亮的轻矿物油（约 50 μl），防止样品在 PCR 反应多个循环过程中蒸发。

D. 放置 96 孔 PCR 板在 PCR 仪上。按以下方法进行 PCR 扩增。如下：94 ℃，1 min；94 ℃，15 s；55 ℃，15 s，进行60次循环；72 ℃，15 s；70 ℃，5 min。

注意：反应体系马上进行荧光分析或在室温下保存最多 36 h，然后进行荧光分析。

（三）荧光分析

A. 按以下各成分配制工作液 400 μl，在 96 孔板的每孔加入 3.5 μl 工作液：

10× 扩增缓冲液 40 μl
20 mmol/L 4种 dNTP 混合液（pH8.0） 20 μl
20 μmol/L 正向引物 INF 100 μl
20 μmo/L MB-green 20 μl
20 μmo/L MB-red 20 μl
1~5 U/μl Platinum○RTaq DNA 聚合酶 40 U
H2O 160-192 μl
总体积 400 μl

标准数字 PCR 反应条件：
试剂 浓度
MgCl₂ 6.7 mmol/L
Tris(pH 8.8) 67 mmol/L
(NH4)2SO4 16.6 mmol/L
β-巯基乙醇 10 mmol/L
dNTPs 1 mmol/L
DMSO 6%（体积分数）
引物 INT 5 μmol/L
MB-green 1 μmol/L
MB-red 1 μmol/L
Platinum○RTaq DNA 聚合酶 0.05U/μL

B. 以 6000 g 离心 96 孔 PCR 板 20 s。
C. 将 96 孔 PCR 板放入 PCR 仪中，按以下方法进行 PCR 扩增。相应的循环条件与温度如下：
94℃，1min
94℃，15s
55℃，15s 进行10-15次循环
72℃，15s
94℃，1min
60℃，5min

D. 将 PCR 板在室温下孵育 10-60 min，然后放入荧光分光光度计中，用 485 nm/530 nm 波长激发 MB-green 荧光，530 nm/590 nm 波长激发 MB-red。计算：red/green 比 = MB-red荧光强度/ MB-green荧光强度，并使用阳性对照来校正 red/green 比。

① 数字 PCR 扩增过程中不能使用巢式 PCR，因为如果在进行数字 PCR 时使用巢式 PCR 不仅不方便，而且会导致污染问题。
② 需选择加热后才会有活性的 DNA 聚合酶。
③ 数字 PCR 反应不需要很长时间（约 2.5 h），但比普通 PCR 需要更多的循环次数，远高于通常所使用的循环次数。因为在某些孔中的模板可能经过几次循环之后才开始扩增反应。高次数循环反应能保证只要孔中有模板，每个 PCR 孔中都能产生几乎相等的 PCR 产物。
④ 用激发/发射波长 485 nm/530 nm 检测 MB-green 荧光，激发/发射波长 530 nm/590 nm 检测 MB-red 荧光。在没有加入 DNA 模板分子时，每孔的荧光通常在 10000-20000 特定荧光单位 （specific fluorescence units, SFU）。