甲基化特异性 PCR

甲基化特异性 PCR是利用2套不同的引物对，分别针对甲基化和非甲基化的 DNA 片段进行扩增。根据能否扩增出相应大小的片段来判断 CpG 位点是否发生甲基化这种方法已成为甲基化检测的经典方法。

甲基化特异性 PCR的基本原理是将DNA经亚硫酸盐处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。

在PCR反应时,设计两套不同的引物对：

一对引物序列针对经亚硫酸盐处理后的甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化(M引物对）；

另一对引物针对经亚硫酸盐处理后的非甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化(U引物对），图解示意如下图。

甲基化特异性 PCR可用于靶基因DNA水平是否发生甲基化。

器材：

离心机、水浴锅/金属浴

试剂：

①0.25% 胰酶、预冷PBS、蛋白酶K、Tris饱和酚（pH 8.0）

氯仿、NaAc (PH 5.2)、无水乙醇、70% 乙醇、TE溶液

细胞裂解液

②限制性内切核酸酶、DNA 片段回收试剂盒

3 mol/L NaOH、20 mmol/L对苯二酚

NaHSO₃ 溶液 (pH 5.0)、8 mol/L NH4Ac

甲基化特异性 PCR的基本过程可分为如下几步：

（一）基因组DNA的制备（贴壁细胞）

A.用0.25% 胰酶消化1X10⁶-1X10⁷细胞，用含10% 血清的细胞培养液终止消化，800 r/min室温离心5 min，弃废液。

B.用预冷的细胞培养PBS洗涤细胞沉淀，50000 r/min室温离心5 min，弃废液。再重复洗涤1次后收集细胞沉淀。

C.加入250 µl裂解缓冲液，缓慢混匀，37 ℃孵育20 min。

注意事项：混匀注意动作要轻柔。

D.加入适量蛋白酶K，使其终浓度达到100 µg/ml,混匀，55 ℃水浴1 h。

E加入150 µl Tris饱和酚(pH8.0)，混匀后加入等体积(150 µl)氯仿轻柔混匀1 min，12000 r/min室温离心10 min，将上清移至一个新1.5 ml离心管中。

注意事项：氯仿轻柔混匀；

G.加入250 µl氯仿，轻柔混匀1 min，12000 r/min室温离心10 min，弃上清。

H.加入0.1倍体积3 mol/L NaAc(PH5.2),混匀后再加入2.2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置30 min或过夜。

I.12000 r/min 室温离心10 min,弃上清，加入1 ml预冷的70% 乙醇洗涤2 min。

J. 12000 r/min 室温离心10 min, 弃上清，将残液尽量吸干，室温量干乙醇，再将DNA溶于适量TE或H₂O中。

注：细胞裂解液：1 mmol/LEDTA, 10 mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，10 mmol/L NaCl，1% SDS，20 µg/ml RNase A，4 ℃保存。

（二）DNA 的酶切及亚硫酸盐处理

A.用适当的限制性内切核酸酶酶切2 µg基因组DNA(避开需要检测的目的片段），50 µl酶切体系，37 °C过夜。

B用DNA片段回收试剂盒回收酶切的DNA，90 µl H₂O洗脱得DNA溶液。

C.加入10 µl新鲜制备的3 mol/L NaOH至终浓度为0.3 mol/L，37℃温育20 min。

D.在上述体系中加入20 mmol/L对苯二酚30 µl，轻轻颠倒混匀，再加入1040 µl新鲜制备的3.6 mol/L NaHSO₃溶液(pH5.0)，轻轻颠倒混匀，离心管外包上铝为纸，避光，并加入200 µl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。55 ℃温育10~16 h。

注意事项：轻轻颠倒混匀、避光。

E.用DNA片段回收试剂盒回收经亚硫酸盐处理过的DNA(如此时处理过的DNA量过大，也可直接将DNA层析纯化），H₂O洗脱得90 µl DNA溶液。

F.在上述体系中加入3 mol/L NaOH 10 µl (终浓度为0.3 mol/L)，37 ℃温育15 min。

G.加入70 µl 8 mol/L NH₄Ac中和至pH7.0，加入10 µl糖原(20 mg/ml)，混匀，加入3倍体积(400 µl)的无水乙醇(-20 ℃预冷)，混匀后置于-20 °C 30 min或过夜。

H.12000 r/min室温离心10 min,弃上清，加入1 ml预冷的70% 乙醇洗涤。

I.12000 r/min室温离心10 min，弃上清，将残液尽量吸干。

1. 不同生物（如植物、动物、微生物）基因组DNA的提取方法有所不同，不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。因此在提取某种特殊组织的基因组DNA时必须参照文献进行相应的操作，以获得可用的基因组DNA大分子。

尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。