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亚硫酸盐修饰后基因组测序

相关实验:DNA 甲基化分析

别名:bisulfite sequencing PCR,BSP

最新修订时间:

简介

亚硫酸盐修饰后基因组测序,是用亚硫酸盐使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。用特殊引物扩增后将产物进行测序,判断 CpG 位点是否发生甲基化。

原理

亚硫酸盐修饰后基因组测序的基本原理是将DNA经亚硫酸盐处理,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时,设计一对不含有CG位点的引物对,无论DNA序列本身经亚硫酸盐处理后是否发生改变,都能扩增得到相应片段。而后经过DNA测序获得目的片段的位点信息,图解示意如下图。

用途

亚硫酸盐修饰后基因组测序可用于此方法是一种可靠性及精确度很高的方法,可以明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态。

材料与仪器

器材:


PCR扩增仪器、DNA甲基化测序仪、离心机、金属浴/水浴锅。


试剂:


①0.25% 胰酶、预冷PBS、蛋白酶K、Tris饱和酚(pH 8.0)、氯仿、NaAc (PH 5.2)、无水乙醇、70% 乙醇、TE溶液、细胞裂解液


②限制性内切核酸酶、DNA 片段回收试剂盒、3 mol/L NaOH、20 mmol/L对苯二酚、NaHSO3 溶液 (pH 5.0)、8 mol/L NH4Ac

步骤

亚硫酸盐修饰后基因组测序的基本过程可分为如下几步:


基本流程包括基因组DNA样品制备、DNA亚硫酸盐处理过程、PCR扩增、PCR产物测序等,与MSP过程基本一致。最终经过DNA序列与原始DNA序列比对后,判断目的片段CG位点是否发生甲基化。

来源:丁香实验

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