亚硫酸盐修饰过得DNA，回收率总是很低，怎么优化呢？

如果你不想把时间花在摸索上面，用试剂盒转化纯化是个选择。一般用DNA重亚硫酸盐转化纯化试剂盒，可以搜一下，跟着Protocal做，DNA样品未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的转化率可高达99%。

第一部分 基因组DNA的提取。

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：

1：紫外分光光度计计算OD比值；

2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

个人倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

3： 42℃水浴30min；

水浴期间配制：

4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。

这一步细节：

1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞卩密喘完全转化为尿 卩密喘，而甲基化的5—甲基胞卩密喘保持不变。影响此过程的主要因素有修饰 试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节 出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：
⑴亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3. 0〜3. 9 mol/L为好，其pH值必须用 NaOH精确调整至5. 0；
（2） 修饰时间应掌握在10〜16 h,修饰时间过长会导致甲基化胞卩密嗟也会转 化成尿卩密咗且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；
（3） 反应温度应控制在50〜55°C （若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53°C 为好）；