DNA末端修饰原理

Chapter 4 replication

DNA replication

DNA damage and repair

Reverse transcription

RNA replication

DNA复制的基本特点

半保留复制(self-conservative replication)

复制子(replicon)

半保留复制

1958年,Meselson 和Stahl首次用实验证实了DNA的半保留复制.

步骤:

用普通培养基(14N)培养15N标记的大肠杆菌.用CsCl密度梯度离心法分析DNA.

加热子一代DNA分子.

复制子(replicon)

复制子:基因组中能单独进行复制的单位.

每个起始点到终止点的区域为一个复制子.

起始点(origin of replication ,ori):原核生物DNA分子中只有一个,长度 200bp左右.大肠杆菌ori C有245 bp.真核生物有多个复制起始点.

终点(ter):D,A,C,B(23bp共有序列)Tus(terminator utilization substance)识别终止序列.

复制的方向:单向或双向

原核生物DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)

1958年Kornberg首先从大肠杆菌提取

DNA polⅠ:聚合作用:5` → 3`

3` → 5`外切酶活性:校对功能

5` → 3`外切酶活性:引物切除,损伤修复

主要功能是切除引物,填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复

DNA polⅠ是单一肽链的大分子,分子量为109kD,二级结构以α-螺旋为主.

用特异的蛋白酶处理,可把DNA polⅠ水解为两个片段,即在F,G螺旋之间发生断裂.

小片段:323个氨基酸残基, 5` → 3`外切酶活性

大片段或称Klenow片段:604个氨基酸残基,DNA聚合酶活性和3` → 5`外切酶活性

DNA pol Ⅱ:5` → 3`聚合酶活性及3` → 5`外切核酸酶活性.

DNA polⅢ: 由10 个亚基组成,分别为α,ε,θ,τ,δ,δ`,β,κ及ψ.是原核生物体内真正起复制作用的酶.

α亚基: 5` → 3`聚合酶活性

ε亚基:3` → 5`外切酶,校对和编辑

θ为装配必须

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ

真核生物DNA聚合酶

α,β,γ及δ四种,都有5`→ 3`聚合功能.α及δ参与核DNA复制;

α:链合成的引发,δ:链的延长

polδ;切除引物后填补空隙

β:外切核酸酶

γ:线粒体DNA复制

其它环状DNA分子的复制

1,θ复制:首先由J.Carins 从大肠杆菌中观察到,又称为 Carins复制.

2,滚环复制(rolling circle replication)

3,D环复制(D loop replication):线粒体DNA复制

端粒与端粒酶(telomerase)

Telomere:真核生物线性染色体3末端的一种特殊结构.核苷酸重复序列富含G,和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物.人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列,长度5~15kb.

作用:保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解;解决染色体复制时末端丢失问题.

Telomerase: 由RNA和蛋白质组成的酶.兼有模板和逆转录酶两方面的作用.

1995年,Junli Feng等克隆了人类端粒酶RNA基因,长约450个碱基的RNA序列中有一段长11个核苷酸的区域(5-CUAACCCUAAC-3)与人的端粒序列(TTAGGG)n互补.

端粒酶蛋白质的分离:四膜虫端粒酶两个多肽成分p80和p95.

端粒与衰老

实验:在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时,端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制.

结论:细胞的衰老是由端粒驱动的.

体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短,丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用.细胞随之发生衰老和死亡.

可把端粒看成一面钟,端粒的长度是钟上的刻度,记载了细胞分裂的次数,称为"端粒钟",或有丝分裂钟 或"生命的时钟",可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命.

胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短,具有无限的分裂能力,原因在于端粒酶的存在.

端粒酶与肿瘤

人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外,绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性,而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性.

肿瘤的端粒长度很短,其继续缩短导致染色体融合,细胞死亡,而端粒酶的激活可以维持端粒的长度,维持肿瘤的继续分裂,增殖.

端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径.

端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标.

可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长,而对正常细胞没有影响.

逆转录(reverse transcription)

逆转录酶 (reverse transcription)

逆转录病毒的基因组复制过程

乙肝病毒基因组的复制

逆转录酶 (reverse transcription)

1964年,Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制.

表明:RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA.

Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制,但不能抑制一般RNA病毒的复制.

表明:转录对于RNA病毒增殖是必需的.

Temin提出前病毒假说:原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物.

1970年,Temin 在Rouse肉瘤病毒,Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶.

多功能酶:

1,RNA指导的DNA聚合酶活性

2,RNA酶H(RNaseH)活性:水解RNA-DNA杂交体上的RNA

3,DNA指导的DNA聚合酶活性:合成互补DNA.

4,没有3`→5`外切酶活性.

特点:

含有Zn2

DNA合成反应要求有模板和引物.

需适当浓度的二价阳离子(Mg2 ,Mn2 )

5' →3'→

逆转录病毒的基因

组复制过程

第一阶段:合成负股cDNA的大部分

第二阶段:以负股DNA为模板合成一小部分正股DNA链.

第三阶段:完成cDNA的全部复制.

乙肝病毒基因组的复制

其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现 ,其DNA聚合酶也是一种逆转录酶.

逆转录病毒:RNA → DNA → RNA

乙肝病毒:DNA→RNA → DNA

试管内cDNA的合成

常用于获得或研究真核生物基因的方法.提取某一种特定的mRNA,经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因.

常用的逆转录酶有两种:来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT;来自鼠白血病毒称为MMLV-RT.

病毒RNA复制的主要方式

1,病毒含有正链RNA,如灰质炎病毒.RNA( ) →蛋白质(酶)→ RNA复制

2,病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒.RNA(—) → RNA( ) →蛋白质,复制病毒RNA.

3,病毒含有双链RNA和复制酶.如呼肠孤.双链RNA → RNA( ) →蛋白质→ RNA(—) →双链RNA

4,逆转录病毒.

讨论题

如何知道DNA复制中先要有RNA引物的合成

原料

新合成DNA序列分析

专一核酸酶水解

某种病毒DNA的碱基组成(摩尔百分比)如下:

A=32;G=16;T=40;C=12

该病毒DNA的特点如何

简要说明怎样进行构建cDNA文库

组织培养的哺乳动物细胞S期长达5 小时,经放射自显影测定DNA复制的速度是0.5微米/分,已知哺乳动物细胞DNA全长1.2米,计算染色体复制时共有多少复制叉在复制

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已知抹香鲸和猪的胰岛素具有相同的氨基酸序列,然而某些抗血清却能将它们区别开来,这岂不与"蛋白质的一级结构决定其高级结构"的理论相矛盾吗 你如何解释

将某种纯蛋白1mg进行氨基酸分析,得19.5μl的异亮氨酸(分子量=131.2),那么该蛋白质的最小分子量是多少

质粒DNA的提取与纯化

1,细菌的培养

2,细菌的收集与裂解

3,质粒DNA的纯化:

碱裂解法

原理:在pH12.0~12.6的碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体变性,而共价闭环的质粒DNA仍为自然状态。