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科研学霸天团，48小时有问必答

问请教免疫组化染色的问题

ykq08

我以前做HE染色的时候，如果染色过深的话会在75%酒精里面浸几秒钟，然后颜色就变浅了，你的会不会是因为酒精脱水造成的呢，仅供参考

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问测得样品浓度太高怎么办？

我是金博士

说明样品没有稀释到测量范围，稀释后再试试

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问如果用小鼠肝细胞免疫兔子应该怎么进行或是要怎样处理肝细胞呢？

huangjuan711

我好像只听过单克隆抗体，大三医学生路过。要得到抗体，自然是相应抗原的诱导了，哦，好像是先得到能产生目的抗体的基因，在整合到受体细胞基因，也有质粒携带的，然后抗原刺激，看是否表达目的抗体，再行筛选克隆成功的受体细胞，传代培养。有专业书籍介绍的吧

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问CBA 的两种试剂盒检测结果之间是否有可比性？

吉小思

有可比性的，因为这两种盒子都是通过荧光强度反应浓度的。

1 回答1116 围观

问免疫组化中边缘效应很明显，请问有什么方法可以消除？

我是金博士

沿着同一方向研磨，磨久一点。还不行的话，试试超声。边缘效应很严重的话，可以在板边缘划线，另外，饱和一下溶剂再跑~~让点好样的板现在展开溶剂中饱和15min左右在展开，点样尽可能在板的中心也可以一定程度上减少边缘效应的影响。

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问如何最大限度地降低组织非特异性染色？

赵栋2012

1.缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。5. 缩短DAB孵育时间或降低DAB浓

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问求问 PBS 的清洗方式选择、次数和时间的选择？

tao0129

1. 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。2. 温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲

1 回答1985 围观

问请问分离 PBMC 的具体实验步骤？

就是这样喵

可以用分离液分离冻存后全血吗?

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问请问一抗和二抗孵育条件如何比较？

tao0129

1.一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1~2 h，而4度过夜和从冰箱拿出后37℃复温45 min。2. 二抗一般室温或37度30 min~1 h，具体时间需要摸索。

1 回答1268 围观

问怎么样用免疫磁珠法分离小鼠骨髓巨核细胞呢？有特定的试剂盒吗？

极客医生

CD41抗体配免疫磁珠加MACS Large Cell column，貌似没有直接偶联CD41的磁珠，但有有巨核细胞分离液啊。

1 回答1861 围观

问内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

赵栋2012

1. 一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10 min 左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30 min。2. 用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。3.现用现配，配好后4℃避光保存。

1 回答1664 围观

问一抗 4℃ 孵育后为什么要进行 37℃ 复温？

赵栋2012

1. 一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片。2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4℃和37℃时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

1 回答2775 围观

问免疫组化中的血清封闭原理？

tao0129

封闭血清的原理主要有两点。第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。

1 回答5202 围观

问补体测定实验中，用到的胎牛血清需要灭活吗？

游刃有余-xiaobao

需要的，补体结合实验需要灭活，最好是活性炭过滤血清

1 回答1277 围观

问苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?

赵栋2012

返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45℃温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50 ml 自来水＋三四滴的氢氧化铵。

1 回答3511 围观

问谁做过免疫细胞化学？

sunny218

将盖玻片用75%的酒精浸泡后，烤干酒精，再放入培养皿中，直接将细胞种到盖玻片上就好。

1 回答1282 围观

问在什么情况下使用TritonX-100？

苹果嘿嘿

核染时使用

1 回答639 围观

问免疫组化结果如何分析？

赵栋2012

1. 阳性着色细胞计数法。在40×光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。2.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（

1 回答2106 围观

问如何把握 DAB 的显色时间？

赵栋2012

1. DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。2. DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间。3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。4. DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能

1 回答1526 围观

问石蜡切片和冰冻切片的比较？

tao0129

1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果

1 回答2988 围观

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