请问悬浮细胞如何做免疫荧光，如何把细胞固定在在载玻片上

悬浮细胞如何做免疫荧光？核心在于固定好悬浮细胞。这是基础，也是最关键的一步。常规的PLL涂片固定法，仍然会掉片。如何解决这个痛点问题，建议使用靶点科技的悬浮细胞免疫荧光专用玻片。简单四步，30分钟，就可以像贴壁细胞一样处理悬浮细胞。

实验步骤：

1. 细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃PBS重悬细胞。

2. 离心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重悬细胞，置冰上固定30 min。

3. 离心、吸去固定液，用15 ml 4℃ PBS重悬细胞，放5 min 后，用PBS再次洗涤细胞。

4. 稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，250 μl 抗体足够用于5x106细胞。

5. 离心细胞，吸去PBS，重悬细胞于第一抗体中，置4℃温育1 h。

6. 用4℃ PBS稀释细胞和抗体至15 ml。

7. 离心，吸去PBS，以4℃ PBS重悬细胞，重复1次。

8. 第二抗体4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，5x106细胞用250 ul 抗体足够。

9. 吸去PBS，以第二抗体重悬细胞，4℃温育1 h，重复步骤6及步骤7。

10. 除非立即观察细胞，否则在进行细胞浓缩的下一步操作之前应以铝萡包裹离心管并冷藏。

11. 离心细胞并以少量PBS重悬（勿用水），将细胞悬液滴于多聚-L-赖氨酸覆层的载玻片上，加上盖玻片，尽可能马上观察结果。

调整细胞数在10的6-7次方左右。PLL处理好的载玻片首先在－20℃预冷10分钟，用取20-30ul滴在载玻片上，不动它，一张片子可以滴2-3个地方，将滴好的载玻片置于50℃左右烤干，大约10min左右，注意不要烤太久，干了就行，取出后冰丙酮固定即可。

A. 离心收集细胞样品于1.5 ml离心管内，吸除上清后轻轻弹散细胞。

B. 加入0.5 ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间(可4°C过夜)。

C. 离心去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分钟。洗涤期间可以用手或摇床轻轻晃动。

D. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50 μL液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

E. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。如果条件许可，可以使用适当的离心机，通过离心把细胞贴紧在载玻片上。

F. 用试剂盒中的正常山羊血清封闭液(E-IR-R110)封闭30分钟。

G. 去封闭液，用稀释的特定一抗湿盒内37°C避光孵育60分钟。为增强与一抗的结合，可以4°C孵育过夜。

H. 去除一抗，用TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟。

I. 去除TBST工作液，加入100 μL稀释好的荧光标记的二抗湿盒内37°C避光孵育60分钟。

J. TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟，期间适当注意避光操作。

K. 复染核：滴加试剂盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，对标本进行染核，TBST工作液洗涤玻片5分钟，洗涤4次去除多余的DAPI染色液。

L. 滴一滴试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液(E-IR-R119)于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。

M. 如果一抗选用适当，在荧光显微镜下可以观察到荧光。

细胞离心，PBS洗3遍，去除血清的影响，洗好后离心，吸弃上清，最后离心管内总共剩含细胞液体500ul左右，打匀，用转移适量至PLL处理好的载玻片上（悬浮细胞最好处理一下），用头平着推开液滴，铺平。自然风干，可以用手来回晃动，加快蒸发，建议时间稍长，15～20min左右。
具体还要自己摸索一下，根据自己细胞情况，数量等调整液体量及时间。

制备悬浮细胞方法同上，调整细胞数在10的6-7次方左右。PLL处理好的载玻片首先在－20℃预冷10分钟，用取20-30ul滴在载玻片上，不动它，一张片子可以滴2-3个地方，将滴好的载玻片置于50℃左右烤干，大约10min左右，注意不要烤太久，干了就行，取出后冰丙酮固定即可。
我用此法作外周血淋巴细胞的免疫细胞化学检测，效果很好，几乎不脱片。

或者用沉淀机也可以把细胞甩在片子上

1.离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml 4%多聚甲醛，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）

2.离心去固定液，用PBS洗涤三次，每次3分钟。洗涤期间可以用手或摇床轻轻晃动。

3.最后一次离心后吸去大部分液体保留约50微升液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

4.稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。条件许可的，可以使用适当的离心机，通过离心把细胞贴紧在载玻片上。

5.用含2％BSA的PBS封闭60分钟。

6.去封闭液，用PBS洗两遍，每次3分钟。

7.用含2％BSA的PBS稀释的特定一抗作用60分钟（37度温箱或者细胞培养箱内）。为增强与一抗的结合，可以作用过夜。

8.去除一抗，用PBS洗涤三次，每次5分钟。

9.去除洗涤液，加入稀释好的荧光标记的二抗作用60分钟（37度温箱或者细胞培养箱内）。

10.PBS洗涤三次，每次5分钟。

11.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。

12.在荧光显微镜下观察。