AM/PI活死细胞染色红绿荧光重叠问题

请问你解决了吗，我也遇到了同样的问题，红绿荧光重叠在同一个细胞内

甲醛固定不是就把细胞杀死了吗？肯定染出来是红色吧？

既然发生了重叠，说明细胞都死了，可能是前期处理时细胞已经老化死亡了。

估计都是死的，但是不确定是哪个环节出了问题，有可能是传代或者是溶解的时候，还是要好好查一下自己的实验步骤！

你看没看试剂盒的说明书？你PI染的时间太长了。或者是。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。这个原因。

贴壁细胞经 0.25%胰酶-EDTA 消化后，收集细胞，用 1x 的Assay Buffer 洗涤细胞，450g，离心 5min，2 次，去除胰酶及残留的酯酶。

染色步骤 (1) 离心得到的细胞沉淀用 1×Assay Buffer 重悬，使重悬后细胞悬液计数细胞量为1×105~6个/ml。(2) 每 1ml 的细胞量加入 1-2ul 的 Calcein-AM（原液），吹打混匀，37℃避光孵育20min-25min。(3) 将试剂盒自带的 PI 原液取 3-5ul 加入上述染色细胞中，室温避光染色5min。(4) 孵育荧光后的细胞，450g，5min，离心去除染色液。 注：细胞进行荧光染色时建议全程避光。 (5) 用 1x 的 PBS 清洗细胞 450g，5min，离心后用 1x PBS 重悬细胞，取3-5ul 滴在洁净的载玻片上，用干净的盖玻片压片后，请及时荧光镜检。 (6) 荧光显微镜下使用 490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用 545nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

是因为都死了吧，绿色的能染活的和死的，红的染死的，这么看来基本都是死的