组织细胞固定在免疫荧光中的作用探讨

1、为什么在免疫组化中标本要进行固定？

（1）防止标本从玻片上脱落；

（2）除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；

（3）固定的标本易于保存。

2、标本固定的基本原则是什么？

（1）不能损伤细胞内的抗原；

（2）不能凝集蛋白质；

（3）不能损伤细胞形态；

（4）固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。

3、常用抗原物质的固定方法的最佳选择是什么？

（1）丙酮的作用是溶解膜磷脂，所有的脂质双层（胞膜、核膜、细胞器膜等）已被破坏，但蛋白和多糖类不受影响。而丙酮固定后不需进行抗原修复，它是一种非交联固定剂。

（2）多聚甲醛固定对酶类和脂类保护的好，易与蛋白发生交联，所以一般经过甲醛或PFA固定后的标本一般需要抗原修复。

（3）蛋白质抗原：95%~100%乙醇；

（4）酶、激素：丙酮；

（5）免疫球蛋白：四氯化碳；

（6）病毒：丙酮、四氯化碳、无水乙醇；

（7）多糖、细菌等：微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮；

（8）类脂（异嗜性抗原）：10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol）。

4、固定的步骤有哪些（包括固定时间、条件等）？

（1）切片前的组织固定：一般石蜡切片前需对组织进行固定，多为12~24h。

（2）切片后的组织细胞固定：一般室温5~10min，4度30~60min。

5、各种固定方法的优缺点是什么？

1）醛类固定剂：双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和肓吹谋昙切Ч己茫尘扒逦浅Ｓ玫墓潭痢£

2）非醛类固定剂Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。

3）丙酮及醇类固定剂：系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。

6、哪些情况下不需要对组织标本进行固定？

研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定。

7、常用固定剂的种类和配方是什么？

（1）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g，0.1mol/LPBS液pH7.4500ml，两者混

合加热至60℃，搅拌并滴加1NNaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。

（2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲甲醛10ml，0.01mol/lpH7.4PBS90ml）。

（3）100%冰丙酮。

（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。

（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。浓甲醛10ml，氯化汞6g，醋酸钠1.25g，蒸馏水90ml）。

（6）醋酸-甲醛液（浓甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理盐水加至100ml）。

（7）Bouin’s液。

（8）Zamboni’s液。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。

（9）PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）。

（10）碳化二亚胺（1-ethyl-3（3-dimethyl-aminopropyl）cardodiimi-HCI）液：2g溶于100ml0.01mol/L，pH7.4PBS中。此液宜用于标记多肽类激素的组织，对标记IgA、IgG效果不佳。

（11）碳二亚胺-戊二醛液（ECD-G液）。

（12）Zenker’s液（重铬酸钾2.5g，氯化汞5g，硫酸钠1g，蒸馏水100ml，混合溶解后，临用时加水醋酸5ml）。

（13）Clarke氏改良剂（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定。

（14）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。

（15）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml。

（16）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存备用。

（17）Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存备用。

丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4℃低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。