细胞免疫荧光探讨

各位丁香园的站友好，本人最近在做选悬浮细胞的免疫荧光遇到一个自己无法解决的问题。如图中所示，这些细胞都是没有药物未处理的，每张图从左到右分别是目的蛋白β-catenin、细胞核（DAPI染色）、merge。正常来说β-catenin应该分布在细胞浆为主，但奇怪的是基本视野下β-catenin都和DAPI重合了，如图2和图4，限于篇幅我只上传有代表性的图片，就是说都分布于细胞核，这个理论上说不通啊。其中图1图2是同一张片子，图3图4是另一张片子，都是慢粒细胞系K562，图5来自leukemia上的一篇文献。图1图3可以看到胞浆分布的是在共聚焦显微镜下找了好久才找到的，而且只有这么一个视野能看到β-catenin的胞浆分布。后面做了几次，视野下全部的β-catenin都核DAPI重合了，想找一个β-catenin分布在胞浆的视野都没有。我看过相关文献，基本是分布于胞浆的。不知道各位站友有没有遇到过这个问题？下面附上我的实验protocol，望各位兄弟姐妹好心解答一下，看看哪里操作有问题，不胜感激！ 实验protocol： 第一天： 1. 用甩片机甩片，1000rpm/min,10minutes，每个载玻片细胞数undefined105。 2. 免疫组化笔在细胞旁画圈，用4%的多聚甲醛固定细胞20min，PBS浸洗玻片3次，每次3min； 3. 0.5%Triton X-100(封闭液配制)室温通透20min；（封闭液成分：10%羊血清+90%PBS）。PBS摇床洗涤3次，每次3 min。 4.在玻片上滴加封闭液（10%羊血清+90%PBS），室温封闭1小时； 5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜； 第二天： 6. 室温恢复15min，PBS摇床洗涤3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，常温孵育1h，后续操作一直避光。 PBS摇床洗涤3次，每次3min。 7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS摇床洗涤3次，每次3min； 8. 用吸水纸吸干载玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。