细胞免疫荧光

细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；2. 用 4% 的多聚甲醛固定爬片 15 min，PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min；3. 0.5% Triton X-100（PBS 配制）室温通透 20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正

（1）固定剂的选择：看实验蛋白在细胞哪个位置表达选择相应的固定剂，3.7%-4% 的甲醛或多聚甲醛是常用的固定剂，适用于绝大多数蛋白；（2）通透剂的选择：一般使用 0.1%-0.2% 的 Triton-X100，而选择甲醇固定一般无需再通透，若蛋白不在细胞膜上表达则不需要通透处理；（3）细胞铺板的密度要合适，不要太密（镜下细胞一个连一个不行），也不要太稀（镜下有屈指可数的细胞不行），细胞密度以达到

免疫荧光封片注意事项： 1. 避免气泡，气泡会严重影响封片效果，并使拍照不准确； 2. 封片液不要滴太多，容易使盖玻片滑落； 3. 组化笔画圈不易过小，否则封片剂无法均匀铺展容易采集不到荧光信号。

1. 将荧光结果图片导入 Image J 软件中；2. 选择 File-open samples-fluorescent cells（400k）；3. 更改通道为「color」，Image-color-channels tool- 将「composite」改为「color」；4. 拆分通道：Image-color-split channels；5. 选中其中一个图片，选择阈值，Image-adju

（1）荧光染料要避光，避免荧光淬灭。（2）在配制 Fluo4-AM 母液时，需要新的无水 DMSO 溶解，因 AM 水解易吸潮，防止其水解，使荧光染料难以进入细胞，影响钙离子探针荧光效果。（3）建议母液现配现用，也可分装保存，但要在 -20℃ 以下密封干燥保存。（4）在处理细胞时要尽量清除培养基残留，避免 AM 基团分解，降低 Fluo4-AM 进入细胞效果，从而减少钙离子探针荧光效果。