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科研学霸天团，48小时有问必答

问最近跟着老师做实验，想咨询一下，做双向免疫扩散时用的合成抗原OVA~undefined的浓度是多少合适？如何控制才能得到最优结果？

dxywode

1）血清学诊断 2）免疫化学分析：沉淀线位置主要与抗原、抗体两者浓度比例有关，沉淀线靠近抗原空，提示抗体含量高；靠近抗体空，提示抗原含量多。分子量大扩散慢，扩散圈小，形成的沉淀线弯向分子量大的一边。如二者分子量相对，则形成直线。 3）抗体效价滴定：固定抗原浓度，稀释抗体；或抗原抗体双方做不同稀释医学|教育网，经自由扩散，一出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。 4）分析抗原性质 5）鉴定抗原或

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问表面效应如何降到最低

府宅

可以颗粒直径的变小而降低表面效应

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问荧光免疫组化背景为什么模糊？

府宅

估计很有可能是样本制作不符合显微镜要求。

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问1. Western blot结果中的背景为什么较高? 2. Western blot结果中无信号或显示信号弱

府宅

1. 抗体浓度过高，洗涤不充分。2. 封闭不充分。3. 使用了不恰当的封闭剂，可尝试不同的封闭剂。4. 曝光过度。5. 操作过程中膜干了。6.发光液质量问题。

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问血清与血浆该如何选择如何制备高质量样本

dxy_gwrp7ndq

可以低温：4℃；低速：人血~2000rpm、小鼠~1000rpm、大鼠~2500rpm

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问有关流式细胞术的问题

府宅

调节补偿可以选择的荧光素偶联抗体比较多，达到我们目的的补偿设置是比较容易的

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问对流免疫电泳实验不出现沉淀线的原因?

陈文豪平邑

抗原抗体在一定的pH溶液中带有电荷，在电场的作用下可发生定向移动。将抗原抗体加入pH8.6的琼脂凝.将抗体置于正极，电泳后则在两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线。

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问我想知道制备好的抗体是不是放在4℃就可以长期使用，不用放到－20℃?反复冻融影响抗体品质吗？怎样提前预支抗体不能用了?

dxywode

1. 收到抗体后请务必在12000rpm 离心1-5min 后再打开管盖进行分装和保存！质优的抗体使用非常特殊的储存管，只有在12000rpm 离心1-5min 才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来。即使是在10000rpm 离心也会导致离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象！2. 对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20 度 or -80 度对绝大多数抗体来说，保存在-20

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问一般什么样的图片能够展现病理程度

dxywode

只有诊断正确，才能对症下药。正确的诊断，来自宿主、病原(因)和环境条件三方面综合分析。

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问免疫组织化学染色过程中，血清封闭能够去除的是一抗还是二抗的非特异性染色？封闭后还是有非特异性染色是不是就只能换一抗了？

dxy_gwrp7ndq

书中“组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:5~1:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入 2%~5% 牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为 10~20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清 (非免疫的)。有明

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问组织切片免疫荧光双标法染色，背景异常的问题？

dxywode

1.适当延长封闭时间，每次洗涤时要充分（个人认为这点洗涤很重要，不是洗的时间足够长就可以的，比如15miundefined3次就不如5miundefined5次），尽量减少非特异性染色；2.切片尽量薄3。共聚焦拍照的话，配套软件很好，可以修得很漂亮

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问免疫细胞培养的上清液除了用ELISA检测，还听说可以用mRNA检测手法，但是对于上清分泌的细胞因子如何收集，如何处理检测？

lzy必有我师

一般检测上清都是用ELISA方法检测啊，简单实用，结果重复性也还可以，没有必要用什么更高级的方法。培养液浓缩用超滤好了，但是真核细胞表达量比较低，比较麻烦。

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问染色细胞核发灰模糊，对比不鲜明的原因有哪些？

师医生说

HE染色，在染色过程中出现有发挥和模糊的情况是很常见的。尤其要注意苏木素染色的时间，同时要注意染色液的周边环境和是否有结晶存在，同时，在整个染色过程中，要严格把握无水乙醇及不同浓度乙醇是否挥发及脱水分化返蓝的整个过程，大量的流水冲洗时间一定要够，要正确使用透明剂。同时，如果是新换的染色液要对片子首先进行预染色。

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问请问有大佬知道混合淋巴细胞反应（单侧），用丝裂霉素处理时，其剂量用多少？

lzy必有我师

间歇用药法 4-6mg/日，每周静脉注射1-2次。连日用药法2mg/日，连日静脉注射。大量间歇用药法 10-30mg/日，以1-3周以上间隔静脉注射。与其它抗肿癌药物合用 2-4mg/日，每周1-2次。必要时也可以2-10mg/日，注入动脉、髓腔或胸、腹腔。膀胱肿瘤预防复发时，4-10mg qd或隔日注入膀胱；治疗时，10-40mg qd，注入膀胱。

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问流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙？

崔果儿

加氯化钙的目的应该是使细胞内钙达到饱和

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问求助！药物诱导细胞凋亡的实验，请求解答

小小袋袋

Q2+ Q4就是所有凋亡的细胞率，spss后续可以对组间进行t检验或者秩和分析，一次不够，我觉得最少三次

1 回答327 围观

问请问ELISA实验，可以不进行预实验么？

师医生说

如果之前没有进行过，酶免法的酶联免疫吸附实验是需要进行预实验的，要进行环境温度，水浴箱温度以及使用的微量加样器进行评估，同样也要对使用的洗板机进行进一步的基板看下是否有其他的污染源存在，在保证实验中，人员，仪器，物料，环境各个环节完好无损的情况进一步使用以上的人血清实验

4 回答398 围观

问做免疫组织化染色实验，片子上老是出现小水珠，如何解决呢？

小小袋袋

感觉首先应该更换脱水剂和透明剂。如果手工染色每提一步要充分沥干。减少前部液体对后面的影响。出现这种情况的切片首先二甲苯去胶。然后重新用好的试剂彻底脱水。再充分透明后。封片。如果为环保透明试剂应尽量晾干切片。

4 回答291 围观

问流式细胞术检测GFP转染的效率相关问题

amethyst2003

一般的话流式检测的细胞数是10000－20000，具体看参数设置了，建议用PBS重悬，一般是不需要固定的，检测所用为第一通道，单色荧光不难的，做一次就知道了。好运哦

1 回答134 围观

问用 HeLa 做自噬， LC3ii 型的变化不怎么明显，怎样才能做出有差异的图像？

西柚味的芋圆

免疫荧光染的是会同时染LC3I 和II 的，这种方法也没问题，在正常细胞和受刺激的细包中都会有LC3的光点，二者的区别是受刺激的成团块状，正常的呈散点状。。。在一些可能会影响LC3的翻译的条件下，可能受刺激的细胞表现为光点也会变多，这个好理解。。。而在自噬基础水平比较低的状态，给了刺激可能也看不出太大区别时可以考虑转染，相当于给个放大镜，放大这一过程。。。这是我这个课题结题之后重新审视这个问题得

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