肺微血管内皮细胞分离

⼀般情况下，应⽤2 g/L的Ⅰ型或Ⅱ型胶原酶消化20 min～30 min。在某些情况下，需要再采⽤1 g/L 胰蛋⽩酶/0.1%EDTA溶液进⾏⼆次消化，但总消化的时间应控制在30 min以内，以减少微⾎管内⽪细胞的损伤。消化后的组织悬液需要⽤⾎清终⽌酶活性，并将组织悬液通过200⽬的⾦属筛去除未消化组织。

选自陈教授文章:

取材　将大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,75%酒精浸泡全身消毒5m in。在超净工作台内无菌状态下剪开胸腔，自左心室剪一小口，右心室心尖处插入连注射器的7号针头，缓慢推注D-Hank′s液15m l，原位冲洗肺脏至肺叶变白；取出肺组织浸泡于冷D-Hank′s液中。用眼科剪、镊去除肺组织表面的脏层胸膜，剪取胸膜下肺组织(厚度不超过1.5mm)。再用D-Hank′s液反复冲洗后置于DME M培养液中备用。

原代培养　将置于DME M培养液中的组织移入一个干燥的培养皿中，加少许血清后，将胸膜下肺组织剪成约1.5mm×1mm×1mm大小的组织块，吸取组织块接种到培养瓶内，将培养瓶倒置于37℃、5%CO2的培养箱中，使组织贴壁20m in后，沿培养瓶侧壁轻轻加入少许DME M培养液(含20%胎牛血清、4mmol/L谷氨酰胺、90U/m l肝素、100I U/m l青霉素和100μg/m l链霉素)，以刚没过植块为宜，再正置放入培养箱中继续培养2h，在倒置显微镜下观察植块贴壁和血细胞迁出情况。组织块植入后最先游出的是血细胞，然后是血管内皮细胞增殖迁出，时间并不固定，可能与取材、动物的个体差异、组织块大小等多方面因素有关。未贴壁或组织块周围迁出大量血细胞的组织块可吸出接种到另一新培养瓶内再次重复贴壁20m in的步骤，已贴壁、且组织块周围迁出血细胞较少的组织块补足培养液继续培养，当内皮细胞自组织块迁出后即可取出组织块，组织块植入后60h无论血管内皮细胞迁出与否，将组织块去掉，并更换培养液，这样既可去除血细胞，又可防止成纤维细胞等其他细胞迁出，以使培养瓶中贴壁生长的主要为P MVEC。

传代培养　为避免培养细胞过度生长，活力降低，细胞长满瓶壁的80%左右进行传代。传代时弃原培养液，加D-Hank′s液清洗两次后加少许0.125%胰蛋白酶和0.01%E DT A的混合消化液，并在倒置显微镜下及时观察，待细胞收缩变圆、细胞间隙增宽时，立即加入含20%胎牛血清的DME M 培养液终止消化，并用弯头吸管把细胞轻轻吹打下来，移至无菌离心管内,1000r/m in离心5m in，弃上清，先加少许DME M培养液(含20%胎牛血清)将细胞轻轻吹散制成悬液，再按1ζ2比例传代并补足培养液，放入培养箱中继续培养，并根据培养液变化情况和细胞生长情况及时更换新培养液。

实验方法：

1. 将动物麻醉后开胸取肺组织，将肺组织切成1cm3 的小块，用PBS冲洗干净。剪去胸膜，剔除大血管。

2. 用匀浆机制备肺组织匀浆，然后放在20μm尼龙筛上冲洗，以去掉红细胞和组织碎片。

3. 消化肺组织：将留在筛子上的组织悬浮于3mg/ml中性蛋白酶的培养液中，在37℃恒温振荡器中孵育16h。将消化液装入离心管中离心（2000r/min，10min），沉淀物悬浮于含1mmol/L EDTA的0.25%胰蛋白酶液中，37℃孵育15min。

4. 加入完全培养液终止胰蛋白酶消化，通过100μm尼龙筛，以去除结缔组织碎片。将滤过液以2000r/min离心10min，并悬浮于培养液中，可进行细胞培养。