简介
Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞对细胞无毒害，广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
原理
Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞的基本原理是利用 Percoll 颗粒渗透压低（＜20mOsmol／kgH20），黏度小，梯度稳定，采用预先形成的密度梯度可在低离心力（200～1000 g ）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。
材料与仪器
试剂：
1．酪蛋白。
2.1xPBS（pH7.2，含 0.9 mmol／L CaCl2 以及 0.5 mmol/L MgCl2)。
3.1xPBS（含 0.02％EDTA）。
4.70％ 乙醇。
5．Percoll 分层液由 10 mL 10xPBS（pH7.2）加入 90 mL Percoll 原液配制。
仪器：
1.10 mL 注射器。
2．小的外科剪、镊子。
3. 15 mL 或 50 mL 聚丙烯离心管。
4．离心机。
5. 10 mL 超速离心管
步骤
Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞的基本过程可分为以下几步：
1．配制酪蛋白液 将 9 g 酪蛋白缓慢加入 100 mL 热的 1xPBS（pH 7.2，含 0.9 mmol／L CaCl2 及 0.5 mmol／L MgCl2），同时摇动容器。125℃ 高压灭菌 1 小时，4℃ 保存 1～2 周，在使用前加热至室温。
2．制备小鼠腹腔细胞
（1）用 10 mL 注射器将 1 mL 酪蛋白液注射至小鼠腹腔，第二天重复注射一次。
（2）第二次注射后 3 小时用 70％ 乙醇消毒小鼠腹部，暴露腹壁。
（3）用 10 mL 注射器（21 号针头）将 5 mL 1xPBS（含 0.02％EDTA）注射至小鼠腹腔。
（4）轻揉小鼠腹部，然后用同一个注射器轻轻将腹腔液吸至 15 mL 离心管。
（5）若需制备更多细胞，可重复以上（3）和（4）多次。
（6）1000 r ／min 或 200 g 离心 10 分钟，弃上清，用 1xPBS 洗 3 遍后收集细胞。
（7）将细胞悬浮于 1 mL 室温 1xPBS 中，通过锥虫蓝染色检查细胞活力。
3．通过连续密度梯度离心法分离中性粒细胞
（1）将 1 mL 收集的腹腔细胞（5x107／mL）与 9 mL Percoll 置于 10 mL 超速离心管中混合。
（2）超速离心混合液（4℃，25700 r ／min 或 60650 g），吸弃含有巨噬细胞和淋巴细胞的第一层液体，收集第二层中的细胞（图 8-1）。
（3）将所获得的细胞加 1xPBS 10 mL，室温，200 g 离心 5 分钟，弃上清。
（4）通过锥虫蓝染色检查细胞活力后，计数细胞后根据需要用 PBS 或合适的培养基将细胞稀释备用。
来源：丁香实验
