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Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞

相关实验:中性粒细胞分离

最新修订时间:

简介

Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞对细胞无毒害,广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

原理

Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞的基本原理是利用 Percoll 颗粒渗透压低(<20mOsmol/kgH20),黏度小,梯度稳定,采用预先形成的密度梯度可在低离心力(200~1000 g )于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll 扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。

材料与仪器

试剂:


1.酪蛋白。


2.1xPBS(pH7.2,含 0.9 mmol/L CaCl2 以及 0.5 mmol/L MgCl2)。


3.1xPBS(含 0.02%EDTA)。


4.70% 乙醇。


5.Percoll 分层液由 10 mL 10xPBS(pH7.2)加入 90 mL Percoll 原液配制。


仪器:


1.10 mL 注射器。


2.小的外科剪、镊子。


3. 15 mL 或 50 mL 聚丙烯离心管。


4.离心机。


5. 10 mL 超速离心管

步骤

Percoll 密度梯度分离法分离中性粒细胞的基本过程可分为以下几步:
1.配制酪蛋白液 将 9 g 酪蛋白缓慢加入 100 mL 热的 1xPBS(pH 7.2,含 0.9 mmol/L CaCl2 及 0.5 mmol/L MgCl2),同时摇动容器。125℃ 高压灭菌 1 小时,4℃ 保存 1~2 周,在使用前加热至室温。

2.制备小鼠腹腔细胞

(1)用 10 mL 注射器将 1 mL 酪蛋白液注射至小鼠腹腔,第二天重复注射一次。

(2)第二次注射后 3 小时用 70% 乙醇消毒小鼠腹部,暴露腹壁。
(3)用 10 mL 注射器(21 号针头)将 5 mL 1xPBS(含 0.02%EDTA)注射至小鼠腹腔。
(4)轻揉小鼠腹部,然后用同一个注射器轻轻将腹腔液吸至 15 mL 离心管。
(5)若需制备更多细胞,可重复以上(3)和(4)多次。
(6)1000 r /min 或 200 g 离心 10 分钟,弃上清,用 1xPBS 洗 3 遍后收集细胞。
(7)将细胞悬浮于 1 mL 室温 1xPBS 中,通过锥虫蓝染色检查细胞活力。
3.通过连续密度梯度离心法分离中性粒细胞
(1)将 1 mL 收集的腹腔细胞(5x107/mL)与 9 mL Percoll 置于 10 mL 超速离心管中混合。

(2)超速离心混合液(4℃,25700 r /min 或 60650 g),吸弃含有巨噬细胞和淋巴细胞的第一层液体,收集第二层中的细胞(图 8-1)。


(3)将所获得的细胞加 1xPBS 10 mL,室温,200 g 离心 5 分钟,弃上清。
(4)通过锥虫蓝染色检查细胞活力后,计数细胞后根据需要用 PBS 或合适的培养基将细胞稀释备用。

来源:丁香实验

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