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科研学霸天团,48小时有问必答
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igG igM 抗体如何制备
dxy_gwrp7ndq
可以采用DEAE纤维素离子交换层析法或葡聚糖凝胶G-200分子筛滤层析,也可用ConA琼脂糖或PA琼脂糖特异性吸收
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问
磷酸化蛋白的 WB 检测怎么操作才能避免去磷酸化?
bamboopiggy
在lysis里加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂
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问
DNA损伤指标(如gamma-h2ax)的foci如何快速准确的计数?
bamboopiggy
应该有图像处理的对应软件,如果没有,可以用ps里面那个点点的功能,最后会告诉你数值
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问
实验小白,拜大神给看下这个免疫沉淀反应到底出没出结果?双向琼扩实验是不是只能定性,不能定量?
dxy_gwrp7ndq
双向琼脂扩散试验常用于定性检测,也可用于半定量检测
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问
细胞如何做多个抗体的免疫荧光染色?
bamboopiggy
可以同时染,如果二抗不一样的话,还可以把最明显的先染,最后染表达量低的
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问
用组织做免疫荧光,最后荧光拍照时组织上那些斑斑点点的非特异性染色怎么去除?
bamboopiggy
都封片了,没法去除了,下次做的时候,降低一下抗体浓度,或增加洗涤次数试试
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问
同一个抗体在不同组织中出现条带不同的原因?
天一湖医者
关键在于成像的过程。同一张膜,可以在成像的时候,做出完全不同的图片结果。显色液的滴加,量,以及曝光时间,条带颜色(要求灰色而不是黑色)。所以最好有图片说明问题。
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问
跑电泳时,结果不清晰咋办
府宅
原因有很多。第一,蛋白上样量可能太少了;第二,上样蛋白太杂了,没有纯净的条带;第三,上样蛋白含盐量或其他离子量太高;第四,配置的胶浓度不合适;第五,样品蛋白经过上样处理液处理的不够充分;第六,胶脱色后浸泡过久等等,还是要结合你自己试验的过程来分析才行
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问
蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker 转上去了,为什么?
bamboopiggy
可能你的转膜时间不够,试着延长一下转膜时间。
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问
WB目标带是空白,周围有背景
bamboopiggy
因为你蛋白浓度太高了,把发光试剂很快消耗光了,来不及拍照,可以试试降低蛋白浓度。
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问
WB胶片背景很脏,有什么解决方法?
bamboopiggy
可以试试把tween的浓度改为千分之一点五
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问
免疫荧光怎么看共定位呢,merge之后有跟DAPI交叠的,也有没有与DAPI交叠的,那这个目的蛋白是表达在哪里呢?
xuchanglu88
其实你看到的文献中大部分是在表明这个蛋白是表达在细胞核,但是具体到表达在细胞核的哪个部位,那则需要更高维度和分辨率的方法去回答。在很多时候,你能够看到你的目的蛋白merge之后与DAPI的交叠就在一定程度上说明目的蛋白表达在细胞核,但要是再探究是核里的哪个位置,那就需要更高分辨率的技术手段了。
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问
有没有大神做神经元内质网应激通路的呀?求抗体推荐🙏 🙏 🙏 🙏
bamboopiggy
去cst官网看看,有专门的ER stress antibody的kit卖,里面有内质网应激的特异性抗体
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问
怎样查找miRNA与蛋白的结合位点
xuchanglu88
这个可以通过生物信息学方法和实验方法,对于生物信息学方法,可以选择TargetScan和miRnada;而实验方法则可以通过免疫沉淀、干扰你的miRNA后检测基因的表达变化等。个人建议先进行上面提到的或者你自己查到的一些软件进行预测,然后再结合实验手段进行验证。
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问
免疫荧光一抗没在摇床上过夜,就只在四度静置过夜会染不上吗?
dxy_gwrp7ndq
不保证能均匀敷上,效果会不好。
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问
碧云天核蛋白提取试剂盒提取后为什么跑wbnrf2蛋白无条单laminb也没有?
bamboopiggy
1.你跑whol lysit的对照了么?对照有条带吗?2.这俩抗体你以前用过吗?切的位置对不?二抗有没有用错?现在提核的技术很稳定,碧云天的盒子应该可以用,不行的话,你买个thermo的盒子试试。那个我用过,没问题的
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问
抗体纯化的方法怎么选择
府宅
固定化金属螯合亲和层析法:配体稳定性高,吸附量大,洗脱条件温和,但同样也更加复杂,因为需要额外的步骤固定金属离子。离子交换层析法:离子交换层析是一种较为常见并被广泛使用的抗体纯化方法。尺寸排阻色谱法:可用于DNA,蛋白质的纯化,缓冲液更改,脱盐等。疏水作用层析法:与蛋白质的作用比较温和,所以能够更好地保持生物大分子的天然结构和生物活性,同时疏水作用也非常擅长从大体积样品中提取低含量的目标蛋白。
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问
WB实验抽提蛋白是用的loading buffer浓度?
whilt-shirt
一般情况都是用5x的,毕竟加到蛋白裂解液里面会稀释loding
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问
我的wb内参条带两边是翘起来的,请问怎么回事呢?
天一湖医者
电泳条带或整体出现 “︶ ”形状,可能原因主要包括两方面。一是电泳速度过快,可通过减少电压等减慢电泳速度。二是电泳温度过高,使得胶变形,可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。
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什么情况下蛋白需要进行超声
未来9
看你的样品种类, 细胞或细菌需要超声处理裂解蛋白
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