流式分析调整染色补偿需要注意什么？

对于荧光补偿的确定，需运用以上补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。应该注意(1)先调节阴性对照管:将原补偿清零，首先调节电压，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE双阴性区。(2)FITC单染管:在理想情况下(没有荧光干扰)，因检测管中不应该出现PE信号，但实际情况是在FITC与PE的双阳性区出现了荧光信号。这个信号就是PE探测器检测到的FITC信号。此时需要通过调节补偿参数，取合适的补偿强度来抵消PE中的信号。如下图所示，调节补偿(PE-%FITC),使得两群细胞FL2的Mean/Median值相同或相近，或通过经验判断(原则为“横平，竖直”)。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，即PE信号与阴性对照一样时，PE对FITC的补偿调节完成。(3)PE单染管:同理，将进入FITC探测器的PE信号通过补偿调节来消除。

①多色实验（超过单色）时，所有荧光染料都要做一个单染孔

②先设置电压，再调整补偿，保证读取样本时的电压与调整补偿的电压一致，也就是说补偿调好之后，不要再改变电压。

③有些抗原表达弱，阳性群不明显，例如IFN-γ-PE，我们可以替换为CD3-PE或补偿微球替换。

需要注意的是：

1. 单色阳性样本需要有足够的阳性细胞

2. 使用和样本相同的颜色，确保强度不低于样本

3. 如果用微珠代替细胞，要注意某些细胞的染色可能强于微珠

4. 上机后，先调整电压，使目标阳性峰在自己的通道上高于其他的通道

5. 记录数据，就算补偿