Eason老歌迷
可能是你的洗脱调节太温和。提高洗脱液咪唑浓度至500mM,还不能洗脱时,可以尝试降低洗脱液pH至4.0,但低pH会也导致金属离子脱落;也可能是 蛋白吸附在磁珠上无法洗脱。对于非特异性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl浓度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100。对于聚集沉淀在磁珠上的,可以在洗脱缓冲液中加入6M盐酸胍进行变性洗脱。
毛利小五郎的徒弟
1.可以改变超声功率或者其它方法破碎细胞。
2. 确保缓冲液中螯合剂,还原剂,咪唑浓度不是很高。
3.在缓冲液中加变性剂(4-8M尿素,4-6M盐酸胍),然后用IMAC介质纯化。
小小小小小芳
1、可能原因:洗脱条件太温和
解决方法:增加洗脱咪唑浓度或降低pH。
2、可能原因:蛋白沉积在介质上
解决方法:减少上样量,优化层析条件。
3、可能原因:非特异性结合
解决方法:缓冲液加2%TritonX-100和NaCl
huarenqiang5
1、根据蛋白质性质调节盐离子浓度增加蛋白的溶解度。增加磁珠的量,提高蛋白结合上磁珠的几率。
2、可以降低咪唑浓度、降低盐离子浓度来增加蛋白与磁珠的结合力。
3、还有一种可能目标蛋白没有his标签,建议Western blot确认标签,重新构建载体。
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