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磁分选去除死细胞

相关实验:免疫磁珠分选免疫细胞及其亚群

最新修订时间:

简介

使用去死细胞试剂盒能够快速而直接地去除细胞培养物或组织来源细胞悬液中的死细胞。试剂盒包含即用型磁珠和用于磁标记细胞碎片、死细胞和濒死细胞的结合缓冲液。磁标记的物质通过磁分选去除,在 25 分钟内获得高纯度的活细胞。

原理

去死细胞磁珠能够识别凋亡和死亡细胞细胞膜上的标志物。用去死细胞磁珠标记细胞,并通过分选柱可以去除死细胞。被磁性标记的死细胞滞留在分选柱中,未被标记的活细胞流过,因此流穿的部分即去除了死细胞。后续可将分选柱从磁场中移出,洗脱被磁珠标记的死细胞。使用去死细胞试剂盒,即使是具有完整细胞膜的早期凋亡细胞也可被去除,另外活化的细胞也可能被标记。

材料与仪器

1. 灭菌的双蒸水;

2. 美天旎去死细胞试剂盒;

3. 细胞滤筛;

4. MACS 分选柱(MS 柱或 LS 柱)和相应的 MACS 分选器(MS 柱使用 MiniMACS 或 OctoMACS 分选器,LS 柱使用 MidiMACS 或 QuadroMACS 分选器)。

步骤

1. 缓冲液准备:使用无菌的双蒸水稀释去死细胞试剂盒中的 20x 结合缓冲液,制备 1x 结合缓冲液,贮存于 2-8℃。

2. 样品准备:待处理的细胞样品过 30μm 细胞筛,计数,300xg 离心 10 分钟,彻底弃上清。

3. 磁珠标记:按每 10^7 个总细胞 100μl 去死细胞磁珠的比例重悬细胞,混匀,室温(20-25℃)孵育 15 分钟。如有需要,加入 1x 结合缓冲液补足体积至 500μl。

4. 准备分选柱:取MS柱或LS柱置于相应的分选器磁场内,加适量 1x 结合缓冲液润洗(MS 柱加 500μl,LS 柱加 3ml)。

5. 磁分选:将细胞悬浮液加至分选柱,收集含有未标记细胞(活细胞)的流传液。加适量 1x 结合缓冲液洗涤分选柱(MS 柱加 4 次 500μl,LS 柱加 4 次 3ml),收集流穿的未标记细胞(活细胞),与上一步收集的活细胞合并。

6. 标记细胞洗脱:从分选器取出分选柱置于合适的收集管上,加适量缓冲液(MS 柱加 1ml,LS 柱加 5ml)用注射器用力推入分选柱,立即将磁标记的细胞冲出。

7.(可选)活细胞富集:为了提高磁分选去除死细胞的效率,活细胞部分可以在第二根 MS 柱或 LS 柱上富集。使用一根新的分选柱,重复上述步骤 4-6。

8. 使用台盼蓝染色镜检,或使用 PI 或 7-AAD 染色进行流式细胞分析。

注意事项

1. 去死细胞磁珠容易受到细菌污染,请在无菌条件下操作。

2. 处理含有血小板的细胞样品时,应使用含有 EDTA 的缓冲液和低速离心(200xg)仔细清洗样品。因为去死细胞磁珠会与活化的血小板结合,活化的血小板又能与单核细胞等白细胞结合。

3. 去死细胞磁珠不能去除没有任何细胞膜残留的死细胞(没有细胞核的细胞器)。

来源:丁香实验

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