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科研学霸天团,48小时有问必答
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wb湿式转膜时电流大小和胶/膜大小、数量有关系吗,要如何换算,同样的条件跑了两块不同大小的胶结果差异较大,求问?
申东熙老伯
电流大,同样的转膜时间就可能把条带转过。与大小,数量没有关系。
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问
小白求助-提蛋白
NatureBios
这个是和手法有点关系,我们可以讲离心转速设高一些。动作再轻一些
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问
请问跑胶时看到条带整体下移,下面没跑开,可能是什么问题?
balalaLy
你配胶的过程没有问题,上面的marker 也是正常的,所以不存在胶混得不均匀或者没有完全凝这样的问题。下面的蛋白没有跑开只能是胶的浓度太低跑不开。有没有可能你配胶的时候看错了用了低浓度胶的配方
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问
请问做elisa的朋友,有没有遇到移液器头掉的情况?
毛利小五郎的徒弟
有呀,移液器上头的时候用点力,然后选择合适的头。
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问
小分子分泌性蛋白要怎么跑啊,一直跑不出来,好烦啊?
申东熙老伯
提高分离胶浓度,缩短转膜时间。
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问
WB小分子量蛋白曝光问题????
小小小小小芳
11kDa分子量蛋白,感觉像有蛋白,因为用的是0.45uM的膜,可以换0.22uM的膜、但是转膜后丽春红染色这地方没看到蛋白。用的是湿转2h,应该可以换成半干转
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问
WB曝光后条带问题,除了背景过深,还有条带全黑。
NatureBios
这次实验有跑内参么,结果如何,全黑考虑 样本是否新鲜 更换封闭体系,延长封闭时间 增加清洗次数 换个一抗
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问
western转膜以后marker很模糊有的条带还转不上是什么原因
NatureBios
在凝胶中marker也模糊么,大概率是上样少了,我们可以增加marker的上样量,浓缩胶到分离胶距离大概1cm,让蛋白压缩在一条线上,转好的膜可以做个丽春红染色,看看转印的效果,转不上的通常是大分子量的,我们可以在转移缓冲液中加入sds
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问
裂解组织后出现粘稠物,电泳时上样孔样品分层而且有残留怎么办?
小小小小小芳
RIPA裂解细胞后的粘稠物质主要是DNA,10000g以上离心五分钟就可以沉淀,取上清液。如果一次离心后还有粘稠可重复一次。
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问
WB曝光后背景噪点太高,求大家指点
毛利小五郎的徒弟
背景噪点高是由于 ① 膜封闭时间不够,室温下通常摇床孵育膜 1h,出现这种情况可以更换合适的封闭液或者适当延长封闭的时间; ② 抗原抗体免疫过程中一抗稀释度太高,可以多设置几组一抗浓度,摸索最适宜的抗体稀释度; ③ 在整个实验过程中膜发生干燥或手套反复接触过也会发生背景值高的情况,因此实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。
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问
求问大佬NLRP3相关通路的wb步骤
麻黄连翘赤小豆
NLRP3和Caspase 两个条带显示蛋白有降解,其他蛋白还好,蛋白降解一个是冻融次数多,还有就是保存时间过长,新鲜组织的蛋白一般降解不多,可以重新做后两个蛋白。前面三个蛋白如果不稳定还是看是不是上样时样品不均一,没有摇匀等问题
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问
请问有没有大佬做过NLRP3相关的wb?
麻黄连翘赤小豆
蛋白表达比较低转膜效率低封闭没封好
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问
组织wb之怪异
balalaLy
有没有可能是前两个样品含血液量多,混进了过多的白蛋白?
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求助:Wb条带求大神解答
毛利小五郎的徒弟
可能是洗膜的时间和次数不够,延长洗膜时间。
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问
蛋白质点杂交求助!
毛利小五郎的徒弟
我解答一下你关于NC膜的疑问:选择硝纤NC膜时要注意的是选择合适的孔径,通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜,小于20KD的话建议选择0.2um的,如果小于7KD的话选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜。混有含醋酸纤维(CM)的NC膜结合力会有所降低。 另外,由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替,因此在封闭时使用较温和的Tween20,而且浓度不要
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问
血清和粪便短链脂肪酸检测
balalaLy
Construction of a sustainable 3-hydroxybutyrate-producing probiotic Escherichia coli for treatment of colitis 最近在看的一篇文献里有这方面的,用的LC-MS方法检测
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问
家人们,WB 15%的分离胶怎么配啊 跑16分子量的蛋白,有什么注意事项吗?
毛利小五郎的徒弟
配置浓缩胶,配方参照文章中表格配制即可将上层双蒸水倒去,灌制浓缩胶,插入样品梳;注意:在灌胶的每一步都要注意不要将气泡灌入胶板中,气泡会严重影响最终的实验结果
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问
有什么好的技巧把内参跑的特别齐
毛利小五郎的徒弟
一定在上样阶段谨慎操作,上样时要保证各组蛋白浓度一致,同体积或同质量。同时,小心上样,避免蛋白丢失,即有些蛋白加到槽外。
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问
Irs和pirs蛋白电泳
bamboopiggy
降低胶浓度,我记得这个蛋白分子量过100了,你用8%的胶试试。
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蛋白沉淀
明査日月
加百分之十甘油对后续实验不会有影响
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