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科研学霸天团，48小时有问必答

问细胞培养上清中的蛋白浓缩后再煮沸，成了豆腐渣一样的东西是为什么？

远航TAJI

说明过表达组培养基中有很多蛋白，分泌性蛋白就是大量存在于培养基，与对照组比较有区别，很正常的啊！我想问，你用什么耗材浓缩的培养基？？？？

1 回答2499 围观

问上样蛋白量在多少范围内（ug）比较合适啊？

yudengsu

但如果是膜蛋白的话，上样量的多少，我上了75ug都没出

2 回答14783 围观

问原核表达在包涵体里，该这么提蛋白做纯化呢？

丕龙兄

1.蛋白在包涵体里很常见，原因也很多，你可以尝试一下其他的解决方案。比如说降低诱导温度，更换表达载体（GST标签有增溶作用，pCOLD低温表达载体…），更换表达菌株；2.如果上述尝试还是不成功，那就只能变性纯化了，用变性剂（如6-8M尿素）溶解包含体，然后过镍柱，这样可以得到大量蛋白，纯化出的蛋白通过透析进行复性，然后测酶活。3.复性的蛋白酶活跟所用的复性缓冲液有很大关系，查文章，用他们的实验方法

1 回答2398 围观

问蛋白分子量相近能跑两张膜吗？

shefoundme

可以，跑两张膜，也可以考虑用一张膜两种荧光二抗检测。

1 回答706 围观

问内参结果不均一的原因？

傲气的鸿雁

可能是你蛋白浓度测得不准，导致你加样误差太大。

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问我最近做western的内参条带特别好，背景也很干净，但是目标蛋白要么没有条带，要么有条带但是背景很脏，为啥呢？

我是金博士

1、内参与目的蛋白用的是相同的二抗吗？2、洗膜3min，5-6次3、背景高，调整二抗浓度4、时有时无，请在转膜后用丽春红染膜

1 回答3486 围观

问WB 的试剂准备应该自己配制还是买试剂盒？能给点建议吗？

lethelich

做WB实验比较花钱的是一抗，国外进口的1支大概在3000元-5000元之间不等（根据你的指标而定），二抗价格相对便宜很多，如果使用荧光二抗的话，1瓶Dylight 2000元的可以使很久。剩下的试剂均可以单独购买，Marker、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白抑制剂最好买进口的，价格可能在1000元-3000元左右（根据公司、规格），剩下买国产的即可，如裂解液、电泳液、电转液、Tris-Hcl、SDS-P

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问从大鼠股骨中用液氮研磨后提取蛋白也是跟常规的组织提取蛋白用的试剂一样吗？

南瓜先生86

如果是提取核蛋白还需要加提取核蛋白的裂解液

2 回答1315 围观

问做 Western 的时候，上样时等体积或者等质量上样有什么区别呢？

liudong150

应该都是等质量上样吧，挑成等体积的话跑出来条带会好看一些，个人意见。

2 回答2198 围观

问beta-actin条带灰度一致，但是宽度不一致？

我是金博士

说明上样量不均匀。

1 回答1166 围观

问水通道蛋白如何提取呢？

塞舌尔墨宝

提取总蛋白，上样检测，利用特异性抗体就可以把你需要观察的对象区别出来

2 回答1110 围观

问双向电泳跑不好啊怎么办？

phhcrab

这个实验比较复杂，要做得好有难度，特别是大胶。样品制备是关键，后续的操作也很重要。试剂尽量用好一点的，不要省这个钱。多向做过的前辈取经，还有可以咨询设备厂家（GE或Bio-Rad）的技术支持。

1 回答475 围观

问我做了好几次 WB，为什么不是什么条带都没有，就是一片漆黑？

我是橙子橙

一片空白的情况下只有Maker条带

1 回答826 围观

问为什么小分子没有转到膜上？

三儿的脚麻了

如果觉得自己的操作没有问题的话，我估计就是实验条件的问题。每次我转膜都是用的恒压，你可以尝试改变一下你的实验条件。比如：电压或者电流（但是那要取决于你是恒压还是恒流）。一点愚见！嘿嘿！加油！

1 回答805 围观

问western blot 可以同时加两种以上的一抗吗？

tao0129

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。

1 回答2897 围观

问蛋白放入-80之前还需要加蛋白酶抑制剂吗？

我是金博士

装冻存，避免反复冻融，尽快检测。不用加蛋白酶抑制剂

1 回答2335 围观

问蛋白电泳中途不给力了怎么办？

tao0129

1. 如果sample 先跑的动，后来就不动了，很可能就是缓冲液的问题，这时候单纯的提高电压是没用的。2. pharmacia 系统跑的时候可以清楚的看到电极丝上面有气泡形成，电压越高气泡越多。有气泡但是sample就是不动，那一定就是缓冲液问题。3. 检查缓冲液的时候，从配胶缓冲液开始查起，有些新同学在配胶的时候可能就是吧浓缩胶缓冲液和分离胶缓冲液弄混了。4. 另外，电泳缓冲液最好是用前现配，尤

1 回答1462 围观

问蛋白质粉碎

丁香通采购助手

如果要破碎细胞的，现在都是用超声波细胞破碎仪吧

1 回答578 围观

问sds-page

我是金博士

煮过就没有问题了，已经变性了呀

1 回答263 围观

问提蛋白时将同组标本随机两两混合了，即（2con：2处理）。请问这样可以吗？

我是金博士

1、你为啥要这么写在文章中呢。。。2、这样做当然是可以的 3、别人的文献中肯定不会这些写撒

1 回答1250 围观

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