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科研学霸天团,48小时有问必答
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hif-2α减少降解求助
Eason老歌迷
提蛋白的时候,全程放在冰上操作。我之前也是降解很严重,放冰上,就效果还不错
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重组腺病毒抗原表达鉴定
秋秋欣欣
是不是病毒量不够,没有转染成功啊
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问
求助,wb糊成一片
府宅
样品量太大了,不论是胶还是膜,承受能力都有限度,这样跑胶蛋白会连成一条线,转膜时候,单位面积的膜能hold的蛋白量是一定的,相同分子量的蛋白太多,目的蛋白的转膜效率可能很受干扰,倒是建议你0.2的PVDF,降低蛋白上样量,提高一抗浓度
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问
ELISA实验结果出现不在线性范围,高可以稀释样品,低的要怎么弄呢?对比OD值,结果能认吗?
汤姆卜丽波
可以搞个再灵敏一点的试剂盒测试一下
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问
input可以做出来,IP一直拉不下来是什么原因
汤姆卜丽波
是不是抗体用的不对,或者两个蛋白之间互作不大
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问
wb实验bca定量做了之后内参依旧不齐怎么办😶
Eason老歌迷
BCA测定的是组织内总蛋白的量,但是由于组织内细胞类型比较复杂,所以所测定的某一特定蛋白的浓度并不准确,以所测浓度作为参考电泳,若结果内参不齐,可以根据各条带的灰度对上样量做适当调整,也就是调内参。若是细胞样品的话,BCA测定结果就比较准确了,跑出来基本上内参都是齐的。实在不行做标曲。
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WB实验内参不齐,怎么校准?
宁儿小贤
提完蛋白之后做一下BCA蛋白定量,将总蛋白调整到同一量级,例如都是七八百,或者都是一点几,一般上样之后就没问题了
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问
细菌WB实验的注意事项
bamboopiggy
我当时是做蛋白纯化裂的菌,可以直接用裂细胞的lysis裂就可以,但是内参,我没有做过,你要不做个蛋白定量试试
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WB结果分析
Eason老歌迷
是一张膜上的吗?如果不是那就可能是哪一步没做好。我看有点像是孵抗体的问题。你一抗二抗怎么孵的
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Elisa
Eason老歌迷
两个点是不够的,可以看看说明书
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问
我又来提问了……突然想到……电泳结束一直没有处理,接近1个半小时以后才转膜,会导致条带不显影么?敷了3个抗体都没显影,内参没敷
汤姆卜丽波
很有可能啊,放久了条带都弥散了
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问
Tri-sus实验求指导!
秋秋欣欣
下游测不出应该是引物有问题,引物可以测一下看看
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问
想买电泳跟电转的机器,有国产的跟进口伯乐的两种选择,有大神知道国产的效果怎么样么,感觉只是电极,有必要用进口的么?资金有限……
秋秋欣欣
资金有限的话国产就够了,有钱的话当然是伯乐的更好啦
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问
小胶质细胞标记物IBA1跑不出来
bamboopiggy
胶用15%的,转膜时间改为300mA,至少要1h,或者2h也可以
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问
wb实验,上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果?
balalaLy
上槽(内槽)缓冲液要加满,至少要没过玻璃短板多一点点,不然影响整个电泳体系的电流,造成电压不稳,条带跑不好
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问
WB转膜时间与分子量及胶厚度的关系?
bamboopiggy
蛋白分子量越大,胶越厚,转膜时间越长
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问
Western Blot实验40V转膜12小时,时间太长了?有什么影响吗?
bamboopiggy
转膜一般是恒流300/400mA,然后1-2个h就可以。如果您的电流是低的,转12个小时也没有问题。
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问
wb实验跑完结果还不错,但是发现中间有个泳道没有加样,我出图的时候可以把中间那个剪切掉吗?这算不算做假图呢?
秋秋欣欣
可以把中间泳道剪掉,重新显影。
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问
wb实验的转膜液除了加甲醇的这个配方,还可以用什么配方?感觉每次用完眼睛都疼
Guoood
可试用快速转膜液或使用半干转,有些是不需要甲醇的。但如果使用PVDF膜是必须用甲醇激活的。
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问
wb实验,出的条带是这样的,该怎么改善,
bamboopiggy
下面这条带ok,上面那条带,建议切宽点,然后抗体浓度加大一倍
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