WB实验内参不齐，怎么校准？

提完蛋白之后做一下BCA蛋白定量，将总蛋白调整到同一量级，例如都是七八百，或者都是一点几，一般上样之后就没问题了

有好多种情况会导致内参不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。PAGE胶的制备也很关键。看到条带信号连在一起，一方面因为胶不好，样品扩散，另一方面蛋白表达量 高，曝光时间长。

内参跑不齐一般是跑胶时电流或电压太大，还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐，试试降低电压，延长时间，纯化样品。

用image j计算灰度值，根据灰度值校准

第一，应该确认每个样品表达GAPDH的量一样，虽然是持家基因，本人觉得不同细菌可能表达量不一样，造成信号强弱不一样。可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异，调整上样量一样再检测GAPDH。

第二，内参跑不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。

第三，PAGE胶的制备也很关键。看到条带信号连在一起，一方面因为胶不好，样品扩散，另一方面蛋白表达量 高，曝光时间长。

第四，转膜的效率会不会是不一致的，一抗、二抗的接合GAPDH不好。都有可能。

第五，做过多次WB还是不行，建议新鲜制备蛋白样品。

建议蛋白变性前测定蛋白浓度，我用的是BCA法，配好标准品，准确定量后再进行蛋白变性，跑内参基本就齐了。

确保上样量一致，加样尽量加靠中间的孔，根据分子量大小适当调整电压

用image J 读一下灰度，然后以比较中间的那个灰度值为准，高的按照比例少上点样，低的多上点

提好蛋白后，都会先去测浓度，然后再去loading ，变性。最后根据每孔上样量（质量）一致，去计算上样所需体积。这样跑出的结果，内参理论就会一致。

算灰度值，根据灰度值调整，可能需要跑几次才能调得比较好