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科研学霸天团，48小时有问必答

问所用缓冲液的体积由哪些方面而定？

丁香粉猪猪

只要知道缓冲对的PH值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度），就能按公式计算盐和酸的量。总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量

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问Wb实验中二抗的作用？

府宅

二抗用于检测细胞或组织样本中的蛋白表达。它与抗原特异性一抗结合，二抗可检测目标蛋白中的高度特异性氨基酸序列。二抗对一抗的指定区域或区域的特异性允许多个二抗与单一一抗结合，放大信号并增加检测敏感性。二抗保存的好可用2-3次。

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问超声粉碎细胞时需不需要冰上操作，怎么样才能不让温度升得太高？

whilt-shirt

正常来说是需要的，但是不太好操作，一般都是超声5-10s放冰上，然后再超声

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问跑磷酸化蛋白是不是不能用奶粉封闭啊？什么替代最好？

YLO6WJ

可以用脱脂奶粉封闭，5%BSA也可以

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问提出来的蛋白样品最多能保存多长时间呢？在什么条件下保存最好？

毛桃子啊

确定每个样品的浓度之后，可将其冻存于 -20 ℃ 或 -80 ℃（一年）以备后续使用。建议分装保存，避免反复冻融。

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问提磷酸化蛋白可以使用超声细胞破碎仪吗？有什么别的方法替代呢？

府宅

可以采用裂解液裂解+超声处理，超声处理时应保持低温，冰上操作。如果没有探头超声仪，用细的注射器针头反复吹打也能起到类似的作用。

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问跑磷酸化蛋白有什么要特别注意的吗？出来的条带不明显，几乎看不到。

staywalking

1.收集细胞在冰上，加入磷酸酶抑制剂。足量裂解液。2.超声样本，促进蛋白溶解。3.增加上样量到40ug.4.根据推荐的方法稀释抗体。5.洗膜 TBST 5分钟三次。6.确定总蛋白是否有表达。然后排查该位点磷酸化是否被诱导，是否在合适的检测窗内（多设时间段）。用成熟的诱导Model制备阳性对照，可能你的模型或者样本里这个位点就是没有被磷酸化。

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问怎样更好的跑出蛋白条带

dxy_gwrp7ndq

1.制胶：先制分离胶，再制浓缩胶，严格按照制胶说明书来就可以了。需要注意的一点是制胶一定要混匀！混匀！混匀！个人经验是每加一种试剂，就混匀一下，直到最后一种试剂加完。对于初学者，还要区分制胶的玻璃板是 1.0cm 还是 1.5cm 的，两者需要的制胶液体量是不一样的。另外，玻璃板一定要洗干净，本人平时都是用洗洁精洗干净然后用水冲洗最后用纯水冲洗，再放在烤箱里烤干并晾至室温。 2.点样：点样的过程

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问蛋白质复性的时候，为什么加入尿素可以增加溶解度，但是尿素会使蛋白质变性，这是为什么呢？

dxy_gwrp7ndq

尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性,使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加天然蛋自质分子中的肽链以一定的方式盘绕曲折，形成特定的构象。这种构象的维持，主要依赖于蛋白质分子中的氢键。尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性。尿素对球状蛋白质变性作用有两点，一是降低蛋白质非极性基因与水的疏水作用，二是尿素对蛋白质酰胺、肽基团的亲和力增强，这两个因素使蛋白质处于一种

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问WB封闭时，什么时候用脱脂牛奶，什么时候用BSA？

府宅

做磷酸化蛋白一般不用脱脂奶，因为脱脂奶中有磷酸化蛋白，会使背景加深。其他时候一般BSA和脱脂奶通用就好了根据经验来说，如果strip液洗过的，用脱脂奶感觉封闭的好一点

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问蛋白质纯度分析的方法有哪些？

毛桃子啊

蛋白质纯度鉴定的方法包括有电泳法、基于层析技术的方法、免疫化学法、蛋白质化学结构分析法和超速离心法等。其中最常用的是电泳法和高效液相层析（即高效液相色谱，HPLC）。质谱法可以与上述方法相结合，实现目的蛋白质和其他蛋白质的精确鉴定。

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问SDS-PAGE电泳怎么区别loading buffer质量好坏？以及电泳的注意事项？

whilt-shirt

Loading buffer即常用的电泳上样缓冲液，工作浓度是1X 。Loading buffer中的还原剂如DTT、beta巯基乙醇可以打开蛋白的二硫键、使之解聚为亚基；还可与蛋白结合使之沉于孔底，易于电泳；同时还有指示作用。一般选用好的公司生产的Loding Buffer。电泳结束后，应及时冲洗电泳槽,以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀。清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝。

3 回答514 围观

问使用Invitrogen iBlot2应该怎么快速转膜？具体步骤

丁香粉猪猪

参考转膜:如何使用 Invitrogen iBlot 2转印系统7分钟快速干转】https://m.baidu.com/video/page?pd=video_page&nid=10074237698057605529&sign=6838240746659596356&word=%E4%BD%BF%E7%94%A8Invitrogen+iBlot2%E5%BA%94%E8

2 回答48 围观

问如何收集带flag标签的蛋白？

wuli猫宁

可以参考本链接，个人认为讲的很全面。【Flag 、HA、GFP标签蛋白纯化介绍】https://mr.baidu.com/r/CYK6W8o4ko?f=cp&u=6f9e5f2331512afd

3 回答235 围观

问western blot 实验步骤的细节问题

府宅

注意事项1、转膜条件：对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，100V、冰浴45min足矣；对于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足够了；其他介于15-150kDa之间的指标100V、冰浴1h完全可以保证效果。2、转膜操作：准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡

5 回答289 围观

问如何对蛋白质组（定性定量检测）庞大数据进行处理？

whilt-shirt

蛋白质组中标准化的工具较少，一般是自己编写代码。一般用apply结合sweep函数来实现。

3 回答162 围观

问ELISA实验常用的酶有哪几种？

whilt-shirt

ELISA是利用酶催化反应的特性来检测和定量分析免疫反应。常用的酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

1 回答336 围观

问为什么WB的条带很模糊？

whilt-shirt

是不是样本已经降解了，重新制备一批新样本试试；也可以调节成像系统的相机焦距试试

4 回答172 围观

问蛋白质定量测定，误差在什么范围内可以忽略不计？

丁香粉猪猪

蛋白含量测定，有好几种方法，你说的是什么方法不同的方法使用的仪器，要求条件，等等不一样，你让我怎么回答？比如：吸光光度法：UV280nm 测蛋白质溶液的吸收值，与标准蛋白对照，得出浓度。BCA法：Cu2+与蛋白质形成络合物，普通光线读取溶液表面“灰度”，得出浓度。

2 回答55 围观

问WB最后显影的结果有非特异性条带，而且比目标条带颜色更深，怎么解决？

whilt-shirt

可以换用NC膜，减少蛋白吸附，降低背景；封闭时间可以延长，过夜；一抗时间缩短，室温2个小时即可；降低上样量和加大一抗稀释度；延长冲洗时间和次数。如果没有好的BSA就换为牛奶封闭试一下，效果可能好一点。

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