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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
常规35-200之间的蛋白,应该用0.45还是用0.2um的转膜纸(pvdf)呢
whilt-shirt
0.45um的就可以,如果是小于10kd的蛋白那就要0.22um的
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问
胶的浓度与已知目的蛋白分子量,怎么确定用什么浓度的胶呢。。我们目前买的是固定比例的啊
太阳阳了
10%最常用,如果你跑的蛋白差距特别特别大的话也可以用梯度胶
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问
文中提到用ncbi确定蛋白是内源还是外源,外源蛋白是不是全长序列;是否是二聚体或多聚体;等,想请问有人可以分享下查的具体指引吗?
wenfengzhu
内源性蛋白或外源性蛋白要看查询结果,直接在NCBI输入要查询的蛋白名称,最好为英文,看是自身表达,同源性基因表达出的为内源性蛋白,外来异物细胞免疫或体液免疫等出现的蛋白是外源性蛋白,此外,体外培养的,或者看和宿主是否有同源异质性,所谓同源性异质性物质,指同一种属的不同物质,有为内源,无为外源。从而确定是为内源还是外源,还要看它们的氨基酸组成,以及连接氨基酸的肽键,看是否有基团的末端切除或丢失,从而
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问
内参(β-actin)出现多条带,如何判断哪条带才是actin?
Eason老歌迷
我们都是很清晰的一个条带,因为内参很好跑。你要说内参为啥多条带,如果要是让我想原因的话,我觉得很可能是loading buffer 里面的DTT可能变质了。
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问
内参总是跑不齐该怎么办?
Eason老歌迷
一个是你要确保你的上样量是一样的。然后配胶一定要混匀。还可能是你跑胶时电压设置的问题。
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问
WB转膜后pvdf膜保存。
府宅
一般常用膜保存液的配方为:水﹕甘油﹕亚硫酸氢钠=79﹕20﹕1保存液温度在5~40℃
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问
质谱检测到的蛋白质翻译后修饰差异,免疫沉淀无法成功验证怎么办?
Eason老歌迷
目标蛋白的PTMs研究通常需要一个富集步骤,因为修饰蛋白的丰度一般较低。大多数PTMs检测方法都是结合富集策略开发的,以最佳识别、验证和研究目标蛋白中PTMs的功能。你可以提高纯化浓度。
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问
WB 转膜后的pvdf 膜保存。
秋秋欣欣
放在TBST 里4度保存,几天没有问题
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问
免疫沉淀IgG出现条带怎么改进?
Eason老歌迷
珠子少加点,wb抗体稀一点,曝光时间短一点。珠子抗体这些不要贪多,不然容易有非特异性条带
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问
膜蛋白IP裂解液及裂解方式是什么?
天一湖医者
通过破坏细胞膜和蛋白间的相互作用等方式裂解组织或细胞;
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问
请问各位前辈条带反白是什么原因导致的
Eason老歌迷
你这是二抗孵育时间太长了,你下次缩短一点孵育时间看看。
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问
有个比较奇怪的问题,请问同样用10%的胶跑了两个分子量都是十几的目的蛋白,称为A和B,为什么A蛋白条带很粗,而B蛋白条带正常
bamboopiggy
可能你a蛋白的表达量高啊,b蛋白的表达量一般
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问
小分子量的蛋白 用15%的胶可以分出来吗?条带大小7KD
秋秋欣欣
15%的胶最佳分离范围为10-40kda, 应该也可以的
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问
封闭之后,需要洗膜吗?
天一湖医者
需要,封闭完成后要进行洗膜,以去除膜上未结合的封闭试剂
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问
收细胞样本时候看着很多,每组加30微升裂解液裂解细胞提蛋白后BCA定量蛋白浓度低,原因?
inventbiotech
如果是在板子里直接进行细胞裂解蛋白提取,样品很多是,裂解液粘稠糊在板子上会影响蛋白得率,板子上直接操作,还会存在因裂解液不强导致的细胞未被裂解,致使蛋白浓度过低。
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问
到底是应该选择半干转还是湿转?
n0y0j7
对于需要加长时间进行转移的大蛋白而言,湿转移更适合。半干时间短,省转膜液
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问
请问,为何细胞里和组织里相同蛋白跑出来的位置不一样? 所配的胶等步骤都是一样,而且重复过很多次。
bamboopiggy
你细胞和你的组织是一个种属的?是同一个器官的?不同器官收的蛋白样,可能跑的位置也不一样。
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问
目的条带时而清晰,时而不存在怎么办?一样的实验条件
inventbiotech
一时可以检测到一时检测不到,可能是样品在进行蛋白抽提时有蛋白丢失导致的,尤其是目标蛋白定位于细胞膜细胞器细胞核等位置上的蛋白,容易发生丢失。当然还有有可能是转膜失败,WB检测过程可以设置质控点,丽春红染色检查转膜是否成功。一步步分析看看原因出在哪里,如果是不是WB检测的问题,那就是蛋白提取的问题,如果是的话,建议使用柱式法总蛋白进行蛋白提取,可以解决这个蛋白丢失问题
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问
转膜后,如何选择抗体,敷抗体的时间怎么把握?
Eason老歌迷
根据你跑的目的蛋白选择一抗,然后二抗的话就根据你选的一抗种属来选择,一抗是鼠的就选抗鼠,一抗是兔的就选抗兔。一抗一般都是4℃孵育过夜。然后二抗常温孵育1.5h,别孵育太久。你可以做几次预实验,调整一下孵育时间,看看什么时间最合适。
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问
BCA法蛋白定量后,内参条带仍然不齐,怎么办?
蜡笔小迟
组织定量本来靠测浓度就不准,建议:先测浓度,按浓度跑内参,然后按内参灰度调整上样量。
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