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科研学霸天团,48小时有问必答
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trizolRNA提取的具体步骤有哪些?
whilt-shirt
称取组织约50mg置于2mLEP管中,剪碎;加入Trizol试剂1mL,匀浆器研磨成浆,移入新的1.5mL EP管中,吹打混匀,室温静置5min;加入200μL氯仿,剧烈振荡混匀,冰上静置5min,4℃ 15000g离心15min;吸取上层透明液体至新开启1.5mL EP管,加入500μL异丙醇,轻轻上下颠倒两次混匀,-20℃冰箱静置30min,4℃ 15000g离心15min;加入200μL 7
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问
RNA提取后,跑电泳无条带是什么原因?
whilt-shirt
有可能是提取时样品量太大了,不要往RNA提取试剂里加太多液氮研磨的组织样品,因为一般来说RNA提取试剂一般加1ml ,这时如果加太多样品的话,1ml的RNA提取试剂抑制不了过多的样品中所含有的RNA酶,所以RNA在提取过程中就会降解。
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问
对于靶基因的干扰实验,shRNA和siRNA该如何选择?
迟C迟
siRNA和shRNA之间进行选择时,要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。 siRNA在细胞中瞬时表达的,通常在3-5天内进行检测,而shRNA可以通过病毒或质粒介导的转染保持稳定。
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问
转染后出现细胞死亡是什么原因造成的?怎么才能优化?
协和再爱我一次
转染试剂有毒性,加的量需要斟酌,最好问过师兄师姐。或者换用毒性更小的温和一点的转染试剂
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问
RNA提取相关的问题
whilt-shirt
1.一定要注意冰上操作,低温离心。2.戴口罩和勤换手套,去任何东西都要带着手套去取。3.每次去器材的时候都要用镊子去夹,镊子要在酒精灯上烧一下。4.所有的器材都要经过 DEPC 浸泡后高压后才可以使用,所需要的氯仿,酒精, 异丙醇等都保证没有被 RNA 酶污染,不能用没有泡过 DEPC 的枪头去提取液体。
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问
shRNA和siRNA区别?
dxy_gwrp7ndq
相比化学合成的siRNA,shRNA具有更多优点:稳定性高、脱靶率低、作用时间长和易导入困难细胞等shRNA和siRNA的区别:
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问
RNA干扰技术温度如何控制?
Kimser
在PCR仪上进行两步扩增反应:94℃和72℃。 PCR产物的纯化是4℃。
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问
哺乳细胞过表达质粒后收细胞时间对抽提全RNA的质量有明显影响吗?
王葱catherine
过表达质粒上面有抗性基因,细胞系构建成功后需要表达稳定,再抽取RNA
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问
小片段RNA干扰致基因表达沉默的具体步骤有哪些?
Kimser
1,制备sirna,有化学合成法和转录法,其中还涉及shrna和Ago蛋白2,转染宿主细胞3,检测靶基因是否沉默
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问
细胞转染si-RNA时,培养基加双抗会影响沉默效果吗?
府宅
大多数不可以添加,因为增加了细胞通透性,抗生素的进入会增加细胞的死亡,但Qiagen的hyperfect系列可以
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问
如何提高转染成功率?
Guoood
首先跟细胞类型有关,挑选转染效率较高的细胞系。然后用转染试剂及载体用无血清培养基稀释,充分包裹30min,再加到低血清培养基培养的细胞。
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问
有没有推荐的提取rna快捷高效率的试剂盒?
养点鱼吃火锅
提RNA很快,15分钟-半小时
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问
动物组织如何提取高纯度rna
丁香粉猪猪
RNA是以核蛋白复合体的形式存在,所以在提取动物RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂,迅速破坏细胞结构,使核蛋白与RNA分离,释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使RNA与其他细胞组分分离,得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性,保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂,如DEPC是RNase的强抑制剂,常用来抑
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问
跑胶时候RNA的浓度多少比较好?
wuli猫宁
【跑胶_RN(浓度、纯度测定)】https://mr.baidu.com/r/CYMO5CUEIU?f=cp&u=1977c84f168fdd41此视频较详细,可以借鉴。
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问
如何提高细胞样本rna提取的量
bamboopiggy
注意细胞和trizol的比例,一般情况,6cm皿长满,可以用1ml的trizol,然后收完不要立即提,室温放置半小时,充分裂解后再提。
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问
多糖多酚植物RNA提取
goonQ2HM
天根的多糖多酚试剂盒挺好用的,就是有点贵
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问
怎么用T4 RNA 连接酶链接RNA分子呢?
lzy必有我师
(二)操作方法1) 进行 RNA 与 RNA 分子连接的反应体系如下:供体 (donor)RNA 100-500ng受体 (acceptor)RNA 250ng10XT4RNA 连接酶缓冲液
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问
RNA提取,在液氮中研磨小鼠组织时,极容易把组织(如肾脏)蹦到研钵外面,有没有好的研磨方法?
bamboopiggy
将组织包到锡箔纸中,进行敲打,碎了后倒出
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问
转染效率问题!!!
dxyv9281
应该先做REALtimePCR检测一下,如果确定低了,然后再做蛋白水平的检测
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问
提rna的同时怎么把蛋白也提取出来?
bamboopiggy
有kit可以,酚氯仿抽提后,上层是rna,中间的白片是dna
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