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科研学霸天团,48小时有问必答
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如何提高提取RNA纯度,避免提取过程中的酚残留?
bamboopiggy
酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿,但酚与水有一定的互溶,因此酚抽后,除可能损失部分核酸外,水相中还会残留酚,而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制,因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性,也可用单一酚作变性己,但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿重抽提。
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问
病料存放旧后测rna数值偏差大是操作不当还是污染可能性大?
迟C迟
样品放久了测OD不准,可能是RNA已经降解了,测出来估计是污染了。
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问
电泳结果中出现纵向条纹的可能原因是什么?
bamboopiggy
样品中盐的浓度高了,可能需要换lysis
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问
抗炎药效学实验,提RNA
府宅
可能是RNA降解了,RNA变成单核苷酸了,就测不出
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问
请问,在提取RNA ,跑琼脂糖凝胶电泳只能跑出两条带,反转录后最为模板 影响定量的结果吗?
bamboopiggy
一般会看到28s和18s两条带。28s是18s的两倍就可以,一般5s是看不清楚的。所以继续往下做吧,没问题
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问
石蜡包埋切片过程中,4%PFA浸泡组织的时间要求,至少24小时吗?
Topmicro
由你的试验目的决定,随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低,过度延长固定时间,易引起细胞内生物大分子过度交联。
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问
各位大佬,鉴定大肠杆菌O抗原血清除了凝集法,还有其他快速的方法吗?
dxy_gwrp7ndq
酶联免疫吸附试验(ELISA)方法进行检查。
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问
用trizol提取总RNA时,在加入氯仿前的步骤都可以放在置于冰上的板子室温静置么?组织加入裂解液后室温放置与插入冰块中有区别么
府宅
上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,其余步骤在冰上操作
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问
难消化的新鲜组织提取出的RNA建库后QPCR不合格,有什么方法可以改善?
bamboopiggy
1.将你的组织,直接放到trizo里,再进行剪碎。2.用液氮将组织冻住后,研钵内弄碎后,再加入trizol。3.买个组织提取rna的kit,可以试试。
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问
【求助】提组织RNA时,为何OD值总是小于1.8
迟C迟
RNA 260/280<1.8说明有蛋白质、酚的污染。
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问
提取鱼类肠道微生物,用来做16s测序,有哪些好的方法?
bamboopiggy
找一个靠谱的公司比什么都重要,尤其是做过鱼类16s的,否则什么样的bug都会给你弄出来。甚至会测不到。
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问
microRNA的提取方法和RNA提取的方法相同么?
迟C迟
原理是一样的,因为提RNA一般指total RNA。但要注意的是很多抽总RNA的方法,包括一些试剂盒,最短组分都在100nt左右。这些方法不针对miRNA,里面的某些步骤会损失大量的miRNA,如果抽提miRNA是为了定量,那肯定是不行了,建议用试剂盒。
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问
提取RNA,然后做需要什么试剂及试剂盒?
迟C迟
trizol法提取RNA,trizol买invitrogen公司的,逆转录试剂盒我们实验室用的东洋坊的,效果不错。
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问
从胚胎中提取RNA时,应注意哪些原则?
迟C迟
1. Trizol试剂含有苯酚,具有毒性和刺激性,注重操作。2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,注重配带手套,样品尽可能盖严。3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率,因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。
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问
SDS凝胶电泳的上样量大家一般用的多少啊?
未来9
一般上样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质)
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问
小白提问,为什么跑western blot条白出来是空白的呢?内参也是白的,苦恼死了
天一湖医者
目的蛋白没转到膜上,或者你根本没分离出来探针有问题
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问
做wb的时候,经常做出来结果漂移,越来越高,是怎么回事?
丁香粉猪猪
当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧,因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙,电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间,条带就可以变得非常的漂亮。 另外,转膜时转膜液要浸没凝胶和膜,否则也可能出现上述情况。
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问
样品脂肪含量太多,需要增添什么步骤?
dxy_gwrp7ndq
脂肪类较多的会采用正己烷萃取等办法去除。
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问
干燥RNA的时候是要干燥到什么程度最好?需要保持湿润吗?
迟C迟
最后的到RNA的上一步是酒精洗涤,提取的RNA当然不是完全干燥,提取后可以用小号枪头洗出较多的液体,剩下就在空气中自然干燥;但是太干就不容易溶解,因为太干的话RNA之间就结合的非常紧密。
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问
cDNA法推断蛋白质一级结构时,引物有哪些设计要求,需要注意的问题?
府宅
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq D
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