cDNA法推断蛋白质一级结构时，引物有哪些设计要求，需要注意的问题？

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

引物设计在基因的相关研究中极其重要，其中自己比较熟悉的一点是基于引物设计的全长cDNA文库的构建。全长cDNA序列的获取是一个十分困难的过程，因此这类数据在GeneBank库中存储较少。在过去的试验中，常见的方法是利用PCR对mRNA序列进行多次扩增，尽可能地获得“全长”的cDNA序列，但是这样的方法很难得到完整的UTR区域。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。

引物的设计一般遵循以下几个原则：1. 具有高度特异性：根据所得到蛋白质的部分氨基酸序对，在数据库内进行检索，找出较为特异的一段作为设计引物的模板。在互联网上常用的数据库如：GenBank 的 PDB（protein data base），SwissProt 等。2. 简并度是指每一个位置上碱基数的乘积。一般认为一条简并性引物的简并度不应大于 100。3. 降低引物的简并度：可以用「I（次黄嘌呤碱基）」来代替，因为理论上 I 可以与任何－种碱基配对。但 I 一般应尽量远离引物的 3' 端。而且如果 3' 末端出现简并性的碱基，则应包括所有可能的碱基，因为 3' 末端碱基的错配会导致 Taq 酶作用延伸反应不能进行。还有一种降低引物简并度的方法是在扩增人的基因时，可以根据偏性密码子来代替高度简并的碱基位置，即猜测（guessmer）。

4. 其他则应遵循非简并性引物的设计要求：引物长度为 19～24 个碱基，G＋C 的含量应在 40％～60％ 之间，3' 末端的碱基最好为 G 或 C，而不要是 A、T 或 I，引物序列中应避免出现重复的互补结构等。

现在设计引物的程序及软件繁多。常用的如：Oligo 5.0、Primer2.0 等。都可以帮助快速有效的进行引物设计。