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科研学霸天团,48小时有问必答
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什么情况下要做ChIP-seq,什么情况下做EMSA?两者有何区别?
bamboopiggy
chip-seq得到的数据比较多,emsa可以对chip-seq找到的序列进行验证,最好两个都做。
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问
重组质粒不表达,什么原因?
Eason老歌迷
菌落PCR的假阳性非常高,应该挑取多个阳性菌株,加入抗生素小摇之后将菌液送去测序,然后再选取正确的菌株进行重组表达,因为,还有可能存在载体上根本没有目的基因的情况,当然就不表达了
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问
如果circRNA的引物既可以扩增出环状RNA,又可以扩增出线性RNA
Eason老歌迷
RNase R检测并非是必须的,但可以作为一个很典型的实验证明和鉴定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验,需要根据具体的实验内容和目的决定是否进行RNase R消化。如果是以qPCR进行定量检测,一般可以不做RNase R检测,即不需要对circRNA进行富集(线性RNA被消化)。
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问
fish技术是基因扩增吗?
天一湖医者
是的,荧光原位杂交技术(FISH)是目前临床病理诊断中一种重要的辅助技术,主要用于基因的扩增、易位和融合,在淋巴造血系统和软组织肿瘤中应该较为广泛。
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问
我想问一下,双CART的构建是构建两种病毒还是构建一个包含两个基因的病毒好?有老师说两个病毒的话会影响转染效率
Eason老歌迷
后一种更好。确实如你老师所言,两个病毒的话会影响转染效率。
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问
请问有人在用CAR慢病毒转染Jurkat 细胞吗?为什么转染之后扩增这么难,还死了一大片。
Eason老歌迷
正常,这跟细胞上病毒受体表达的多寡以及细胞的抗病毒能力有关,这两个原因一般无法克服。给提供几个常见的解决方法。一个是加助侵染试剂。二是浓缩病毒,4摄氏度,10K蛋白截留柱离心浓缩,提高病毒滴度后在感染,可以提高感染阳性率。三是分选阳性细胞,一般情况下,慢病毒感染Jurket、THP1这种有免疫能力(指的是分子免疫抗病毒能力)的细胞,基本上不可能做到100%感染,如果你感染以后有分选标签,做一个流式
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问
请问做circRNA的大佬 大家PCR的时候 有p出来好多条条带嘛
Eason老歌迷
出了不少杂带了呗?有很多原因,可能是引物的特异性不高。也可能是酶的用量偏高或酶的质量不好。可能是 Mg2+浓度偏高。或者是 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。也可能是外源DNA污染。
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问
DNA纯化
秋秋欣欣
A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min,丢去上清夜,收集菌体。B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积
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问
质粒稀释后细胞上样浓度是160Nm,想计算100ml稀释液中需要多少ug干粉?
Eason老歌迷
ug/L和ng/ml其实可等量换算,因为1微克=1000纳克,1升=1000毫升。如果现在的标准单位nmol/L换算成原来的老单位ug/L,应除以3.12,即nmol/L/3.12 =ug/L
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求助LC/MS检测circRNA翻译产物的问题
天一湖医者
质谱测序不能cover你所有的序列,也就是说你通过它能知道你基因的reading frame没错,但不知道这个蛋白的开始和结尾在哪个点上。我觉得最好的办法用质谱测你完整蛋白的分子量,如果和你的理论值一样,那就是蛋白在胶上的电泳行为的问题,
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紧急求助大佬
Eason老歌迷
按照你的思路,自杀质粒应该携带目的片段降解了,但是事实是没有降解,那就说明这个降解通路收到抑制或者是压根就是没转染上。
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上游引物连微球
天一湖医者
这个要看引物长度较短,一般会降低扩增特异性,但会提高有效性,扩增的产物种。
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包涵体的溶解液,只用脲就可以了吗?有没有更具体的配方?
Eason老歌迷
可以直接用8M的脲或 6M胍融解,取上清,测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。
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问
重组质粒双酶切后看不到目的片段,上面那个载体一万多bp,底下这个载体5000多bp,怎么回事?
Eason老歌迷
连接产物酶切后跑胶没见目的片段可能是目的片段量比较少,没有电泳检测不出,挑菌提质粒后有没有目的片段可以用PCR检测一下。
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问
请问大家,这个质粒图谱的平行箭头表示什么?为什么会有两个平行箭头?为什么箭头有反向?
Eason老歌迷
质粒上有多个基因,基因的方向不一样,所以就有不一样的箭头方向。如果一个图谱上有两个方向,可能是有两个启动子。
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问
Southern Blot
Eason老歌迷
背景有点高啊。你可以降低探针的浓度。或者延长封闭时间。或者提高洗膜温度,增加表面活性剂,降低盐浓度。或者用高质量的滤纸接触膜试一试
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怎么收集细胞上清进行酪蛋白ELISA检测?直接保留上清还是收集细胞后离心保留上清?
balalaLy
直接收集不同时间点的细胞上清,离心去除杂质
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问
关于突变信号肽序列研究的相关问题
Eason老歌迷
肯定是不能的。信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15~30个氨基酸组成。包括三个区:一个带正电的N末端,称为碱性氨基末端。一个中间疏水序列.以中性氨基酸为主,能够形成一段d螺旋结构,它是信号肽的主要功能区。一个较长的带负电荷的C末端,含小分子氨基酸,是信号序列切割位点.也称加工区。一般使用定点突变。
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EMSA求教!!!
天一湖医者
EMSA实验需要设置许多组对照实验。EMSA非放射性探针设计要注意:(1)防止错位配对、封闭成环,排除目标序列以外结合位点的(2)防止产生空间位阻(3)注意AT/GC比例(4)EMSA探针不宜太长,一般是几十碱基对。太长会产生过多结合位点导致结果分析困难,还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。(5)建议采用Biotin或红外荧光标记,尽量不要采用DIG标记。,探针两端都有标记以提高灵敏度
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Southern Blot
天一湖医者
Southern杂交实验中,基因组酶切后跑电泳用的胶需为9.8cm×8.0cm 大小
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