丁香实验-30万科研人都在用的实验宝库

搜索到 339 条结果

综合

专题

实验

方法

问答

文章

反转录 RT-PCR 实验进阶

专题67 内容 578 订阅

相对 RT-PCR: 样品定量实验

已知线性范围的循环参数和 18SrRNA 引物与竞争子的比例，就可以用自己的样品去做相对定量 RT-PCR。下面配制的 PCR 反应混合物包含 9 个反应（4 个样品、4 个非反转录对照、1 个不加模板的对照）及 10% 的额外份额。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

实验概况收录 1 操作方法 · 3 相关问答 · 3 相关文章

竞争性 RT-PCR: 拷贝数的评估

在预实验中，对样品和竞争子应分别做反转录，然后，不变的这种样品反转录产物的量与竞争子反转录产物 2 的对数倍稀释的量相结合，用于 PCR，这种方法可以确定样品的最适拷贝数。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

实验概况收录 1 操作方法 · 3 相关文章

RT-PCR技术

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

操作方法所属实验：逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr）

实时 RT-PCR 实验

min，以使 DNA 酶 I 失活。2.每次进行 RT-PCR(20ul) 时，PCR 管应放在冰上混合各种成分。逬行多个反应时除了 RNA, 可以把所有的试剂混在一起，然后分装。反应条件：25°C 孵育10min，42°C 保持 30~50 min,70°C 再保持 15 min, 最后在冰上冷却。3.反转录完成后，最好加入 1ulRNA 酶 H,37°C 孵育 20 min 以消化剩余的 RNA。用上面所述的Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG 反转

操作方法所属实验：实时 RT-PCR 实验

问Western与RT-PCR的区别？

小坏2012

Western blot 检测的是蛋白水平，而RT-PCR检测的是mRNA，即基因水平的变化，一般来说，二者是平行关系，即基因水平的变化会引起蛋白水平相应的变化，但是从基因到蛋白也存在修饰等因素存在而出现基因水平升高而蛋白水平没有变化的情况，所以二者反应的是不同层次的变化。

实验问答2 回答1967 围观

问RT-PCR 没有产物是为什么？

我是金博士

GSP是反义序列。5）起始RNA量不够建议解决方法：增加RNA量。对于＜50 ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1 μg到0.5 μg乙酰BSA。6）RNA模板二级结构太多建议解决方法：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。注意：不要

实验问答1 回答1084 围观

RT-PCR 引物的选择

随机引物适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。 Oligo dT 适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具PolyA 尾巴。）由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长 cDNA 合成量大大减少。基因特异性引物与模板序列互补

文章资讯1505 阅读

定量RT-PCR （Quantitative RT-PCR）

A = B(1+e) n A=amplified products, B=input templates, n=cycle number, and e=amplification efficiency. Factors affecting amplification efficiency in the RT-PCR process include the efficiency of reverse

文章资讯2570 阅读

应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）

RT-PCR技术可应用于：（1）构建大容量cDNA文库；（2）鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性；（3）测定基因表达的强度。

实验概况收录 1 操作方法 · 3 相关文章

竞争性 RT-PCR: 竞争子 RNA 的构建实验

第一部分：竞争子的设计；第二部分：竞争子RNA的合成、纯化和定量。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

实验概况收录 1 操作方法 · 3 相关文章

相对 RT-PCR: 样品定量实验

可以用来比较样品间模板 RNA 的相对表达量。用样品 1 的标准化信号/样品 2 的标准化信号可以得到一个比值，以倍数或百分比表示。相对定量 RT-PCR 的实例见图 13-4。

操作方法所属实验：相对 RT-PCR: 样品定量实验

竞争性 RT-PCR: 拷贝数的评估

加热 10min，变性二级结构，然后立即放在冰上。7. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。8. 加 1ul 的 20U/ulSUPERaseIN。9. 加 1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。10.42°C 孵育 lh。11.95°C 加热 10min 使逆转录踌失活。12. 继续进行扩增反应，或-20°C 储存。第二部分：PCR 扩增这一方案中 PCR 扩增的宗旨与相对 RT-PCR 中描绘的相同（见方案 1)。方案设计包括6 个反应及额外的 10% 份额。这对于一个

操作方法所属实验：竞争性 RT-PCR: 拷贝数的评估

问有用胎盘组织做RT-PCR的吗？

yhy_yun

你可以试试其他内参，例如U6等，胎盘组织和人体其他组织的成分是不一样的。

实验问答1 回答1314 围观

问RT-PCR出现非预期条带是怎么回事？

我是金博士

可能原因：1. 物和模板非特异性退火，建议解决方法：在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。2. GSP设计较差，建议解决方法：遵循用于扩增引物设计的同样原则。3. RNA中沾染了基因组DNA，建议解决方法：使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。

实验问答1 回答1322 围观

RT-PCR 原理与实验技术

性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A.变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C.延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2＋存在下，退火引物沿 5‘ —— 3’ 方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。 3. 逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性： (1)依赖 RNA

文章资讯883 阅读

RT-PCR步骤

一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。9. 7500×g，4℃离心，10min。10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体

文章资讯38211 阅读

相对 RT-PCR: 引物与竞争子比例的决定实验

这个方案的目的是要选择一个 18SrRNA 引物和竞争子之间的恰当比例，可以模仿目的转录本的表达量。对于大多数转录本来说，一般比例为 3:7。对于模板比较稀少的，采用2:8 或 1:9 可能更恰当。准备的 PCR 反应混合物应比 5 个反应多 10%。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

实验概况收录 1 操作方法 · 3 相关文章

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr）

逆转录-聚合酶链反应可应用于：(1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。

实验概况收录 4 操作方法 · 26 相关问答 · 3 相关文章

应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）

酶促催化使RNA反转录为cDNA第一链。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与 mRNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。依据实验的不同目的，针对单链cDNA第一链合成的引物可根据特殊的靶基因设计特殊的引物与之杂交，或可用随机引物与所有mRNA杂交等。

操作方法所属实验：应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）