RT-PCR 引物的选择

随机引物

适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。

Oligo dT

适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具PolyA 尾 巴。）由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。

基因特异性引物

与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时性引物代公司的 SuperScript One-Step System 特别适合于与基因特异性 引物连用。

PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因	建议
引物	引物特异性差	重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性或使用 巢式 PCR
引物浓度过高	适当减少引物浓度
Mg2+ 浓度	Mg2+ 浓度过高	适当降低 Mg2+ 浓度，从1mM 到 3mM，间隔 0.5mM 进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
耐热聚合酶	酶量过多	以 0.5U 为间隔适当减少酶量
退火温度	退火温度过低	适当提高退火温度或采用二阶段温度法
PCR 循环次数	PCR 循环次数过多	减少 PCR 循环次数

操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；

最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。