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RT-PCR引物的选择

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随机引物              适用于长的或具有发卡结构的 RNA 。适用于 rRNA mRNA tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。                                                    Oligo dT               适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA 。(原核生物的 RNA 、真核生物的 Oligo dT rRNA tRNA 不具有 PolyA 尾巴。)由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上,所以对 RNA 样品的质量要求较高,即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。                                                    基因特异性引物    与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的 SuperScript One-Step System 特别适合于与基因特异性 引物连用。

 

PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异

 

性扩增带与非特异性扩增带。

 

 

 

原因

 

建议

 

引物

 

引物特异性差

 

重新设计引物,改变引物的位置和长度,增强其特异性或使用巢式PCR

 

引物浓度过高

 

适当减少引物浓度

 

Mg2+ 浓度

 

Mg2+ 浓度过高

 

适当降低Mg2+ 浓度,从1mM3mM ,间隔0.5mM 进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。

 

耐热聚合酶

 

酶量过多

 

0.5U 为间隔适当减少酶量

 

退火温度

 

退火温度过低

 

适当提高退火温度或采用二阶段温度法

 

PCR 循环次数

 

PCR 循环次数过多

 

减少PCR 循环次数

 

 

 

 

4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将 dNTP 、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;
5. 最后加入 反应模板 ,加入后盖紧反应管

 

 

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