RT-PCR引物的选择
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随机引物 适用于长的或具有发卡结构的 RNA 。适用于 rRNA 、 mRNA 、 tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。 Oligo dT 适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA 。(原核生物的 RNA 、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具有 PolyA 尾巴。)由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上,所以对 RNA 样品的质量要求较高,即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。 基因特异性引物 与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的 SuperScript One-Step System 特别适合于与基因特异性 引物连用。
PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异
性扩增带与非特异性扩增带。
原因
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建议
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引物
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引物特异性差
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重新设计引物,改变引物的位置和长度,增强其特异性或使用巢式PCR
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引物浓度过高
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适当减少引物浓度
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Mg2+ 浓度
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Mg2+ 浓度过高
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适当降低Mg2+ 浓度,从1mM 到3mM ,间隔0.5mM 进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
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耐热聚合酶
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酶量过多
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以0.5U 为间隔适当减少酶量
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退火温度
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退火温度过低
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适当提高退火温度或采用二阶段温度法
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PCR 循环次数
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PCR 循环次数过多
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减少PCR 循环次数
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4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将 dNTP 、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;
5. 最后加入 反应模板 ,加入后盖紧反应管