分子在纯化时若无商品化的亲和填料可供选择,也可以利用预活化填料,按照说明书介绍的流程,自行偶联生物分子到填料上,形成独有的亲和填料,来分离纯化其对应的生物分子,如酶/底物、抗原/抗体等。如需要纯化某种单抗,可以将相应的抗原偶联到预活化填料NHS activated Sepharose 4FF或CNBr activated Sepharose 4FF上,然后通过亲和层析实验,就可以实现抗体的高纯度纯化。偶联配基时,需要考虑活化基团是否与填料匹配,以及填料本身是否带有间隔臂。如果偶联的配基是蛋白质
复合模式层析原理 复合模式层析是一种集合多种类型的相互作用(如离子交换、疏水、氢键、嗜硫亲和等)于一种层析介质从而同时具备高选择性和高分辨率的层析技术。 图15 复合模式层析配基类型 特点 相较于传统层析模式具备更快的传质速率和更高的分辨率。 在高回收率条件下实现有效分离。 能够同时去除多种杂质,如多聚体、宿主蛋白、病毒、电荷异构体等。 适用于难以同时去除多种痕量杂质的层析需求。 层析介质 目前Cytiva共有四款复合模式层析介质: Capto™ Adhere系列可有
凝胶过滤层析原理 凝胶过滤层析是根据分子大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。当生物分子通过凝胶过滤填料时,分子量大的生物分子只能通过大的孔径,小分子量的生物分子会经过小的孔径,因此和大分子量的生物分子相比,小分子量的生物分子经过的路程会更长。凝胶过滤层析的全过程只用一种缓冲液即可将不同分子量的生物分子进行分离。 特点 填料主要为惰性(无反应性或吸附性)的球状疏松多孔颗粒,具有均匀的分离范围 目标分子不与介质结合,通常仅需一种缓冲液 缓冲液成分不直接影响分辨率(即峰之间的分离
方式简单温和,通常采用盐离子梯度方式进行洗脱,少数情况使用pH梯度洗脱 回收率高 基本步骤 离子交换层析作为一种吸附性层析,主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再生步骤 (图6)。离子交换层析一般在特定pH的低盐缓冲液中进行上样,经过上样和清洗之后,通过增加洗脱液中的盐浓度逐渐对不同的分子进行洗脱。 图1 离子交换层析的基本步骤 适用性 离子交换层析适用于所有类型的目标分子 (如蛋白质、核酸、多糖、疫苗、病毒等),也适用于纯化从捕获到中度纯化到精纯的所有步骤以及小试、中试、放大等所有规模。