亲和层析

亲和层析原理

亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性相互作用来分离物质的层析方法，如酶和底物、抗原与抗体等非常专一的相互作用 （图9)。配基被固定在填料上，可以结合相应的生物分子，再采用合适的方法如降低pH值、离子强度等，或添加和配基或者目的分子类似的基团，使目标分子以活性的形式被洗脱。

图9 亲和层析原理

 

特点

• 速度快，操作简单，可以快速将目标蛋白与大量杂质进行分离
• 特异性高，经常一步即可达到大于90%的纯度
• 配基种类繁多，填料选择性高 （包括纯化标签抗体蛋白、抗体、酶类、DNA结合蛋白等）
• 可以完成一般方法很难完成的分离，如变性和非变性蛋白、功能不同的蛋白的分离
• 属于一种吸附层析，载量高，具有高效的捕获和浓缩作用。

 

基本步骤

亲和层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再平衡步骤 （图10)。由于亲和作用需要在特定的条件下结合和洗脱，亲和层析需要使用特定的结合缓冲液和洗脱缓冲液。

图10 亲和层析的基本步骤

 

 适用性

• 带有标签的融合蛋白纯化，如His标签蛋白、GST标签蛋白等。
• 抗体及抗体片段的纯化
• 其他和某些配基有特异性结合作用的分子的纯化

 

 填料

根据亲和层析的几种应用方向，亲和层析的填料主要分为标签蛋白纯化填料、抗体及抗体片段纯化填料、族特异性亲和填料以及预活化填料四种。

 

1. 标签蛋白纯化填料

为了简化纯化流程以及方便后期的检测，在进行重组蛋白表达时往往会加入标签。常用的标签包括His标签、GST标签、Strep标签及MBP标签等 （表8)。His标签由于分子量很小，几乎不会影响靶蛋白结构和功能而被广泛使用。GST和MBP标签常用于促进蛋白的可溶表达，尤其对于难表达的真核细胞蛋白和病毒蛋白有很好的促溶表达能力。Strep (II）标签为小分子量的蛋白纯化提供了另一种选择。在有些蛋白的表达时，也可以采用双标签系统，在蛋白上添加如His和Strep (II）两个标签，使用两个标签分别对蛋白进行纯化。

根据蛋白上所添加的标签选择相应的填料对蛋白进行纯化，常见的标签纯化填料及其特点如表9.

2. 抗体及抗体片段纯化填料

抗体的纯化主要是使用基于protein A及protein G配基的填料，尤其是基于protein A配基的填料，从1958年protein A蛋白被发现，到目前已经经历了多次的更新换代，Cytiva最新的基于protein A的填料为2017年上市的Mabselect PrismA （图11)，该填料对人IgG可达80 mg/mL的载量，同时0.5 M NaOH清洗300个循环后仍可保持90%以上的载量，载量高，寿命长，使得MabSelect PrismA很快成为目前抗体纯化的首选填料。

 

图11 基于protein A的填料的发展历程

Protein L可结合kappa类型抗体轻链可变区，因此protein L的填料可用于Fab、ScFV以及Dab等抗体片段的纯化。另外，还有KappaSelect及LambdaFabSelect的填料分别作用于Kappa类型和Lambda类型轻链抗体的轻链稳定区，可用于包含相关区域的抗体片段的纯化 （表10)。

表10 常见抗体及抗体片段纯化填料类型及其特点

1. 族特异亲和填料

某些配基可以与某类生物分子发生特异的亲和作用。将这些配基偶联到填料之上，便形成了族特异性填料。如果涉及细胞因子、白蛋白、糖蛋白之类样品的分离纯化时，除了常用的离子交换层析和凝胶过滤层析之外，族特异性亲和填料也是一种选择 （表11)。

表11 常见组特异性亲和填料及其能结合的分子

 

3. 预活化填料

目的分子在纯化时若无商品化的亲和填料可供选择，也可以利用预活化填料，按照说明书介绍的流程，自行偶联生物分子到填料上，形成独有的亲和填料，来分离纯化其对应的生物分子，如酶/底物、抗原/抗体等。如需要纯化某种单抗，可以将相应的抗原偶联到预活化填料NHS activated Sepharose 4FF或CNBr activated Sepharose 4FF上，然后通过亲和层析实验，就可以实现抗体的高纯度纯化。偶联配基时，需要考虑活化基团是否与填料匹配，以及填料本身是否带有间隔臂。如果偶联的配基是蛋白质，并且分子量相对较大时，一般建议选择具有间隔臂的填料，可以有效地避免空间位阻效应，获得高载量的填料 （图12)。

图12 常见预活化填料及其可偶联的配基类型