亲和层析

亲和层析法是分离蛋白质酶等生物大分子的一种极为有效的方法。它在 蛋白质分离技术中占有特殊的地位。前面讨论的各种分离方法是根据混合物 中蛋白质之间的物理性质和化学性质(如蛋白质的溶解度、电荷、分子大小 或疏水作用等)的差别来纯化的。这些方法的主要缺点是具有相似性质的蛋 白质，由于性质差别微小而难于分离，而亲和层析是根据某种蛋白蛋对于某 种配体的生物专一性。因此，如果能利用这种不同的生物专一性作为分离的 基础，就会产生一种有效的纯化蛋白质的方法。早在1910 年，就有人发现 淀粉能吸附淀粉水解酶，在1951 年，有人以“免疫吸附剂”的形式来分离 抗体；1967 年，Werle 等人开始用胰蛋白酶的不溶酶提纯胰蛋白酶抑制剂， 等等。经过几十年的研究，逐渐发展成一种新型的分离技术——亲和层析。 细胞内任何一种蛋白质都有专一作用的对象。因此，从原则上讲，所有的蛋 白质都能通过亲和层析来分离和纯化。与蛋白质发生亲和作用的基团称为配 体（ligand）。配体是指能被生物大分子所识别并与之结合的原子、原子基团 和分子。例如，酶的作用底物、辅酶、调节效应物、激素的受体、抗原与抗 体互为配体。
1、亲和层析的基本原理蛋白质与配体之间有一种特殊的亲和力，在 一定的条件下，它们都紧密结合成复合物，如果将复合物的某一方固定在不 溶性载体上，就可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。与其他方法相比， 亲和层析能产生绝对的纯化作用，因此，可达到较高的纯度。采用一般的方 法是提纯酶、抑制剂等生物制剂，操作十分复杂，而采用亲和层析，只需一 步就能提纯百倍，甚至千倍，从而得到纯的产品，产率可达到75%~95%。
2、亲和层析的基本方法先将提纯的某种蛋白质的配体通过适当的化 学反应，共价的连接在载体颗粒表面的功能团上。这种载体材料在其他性能 方面，允许蛋白质自由通过，当含有待提纯的蛋白质则与其特异的配体结合， 因而被吸附在配体的载体的颗粒表面，而其他的蛋白质因对这个配体不具有 特异性的结合位点，将通过柱子而流出。被特异地结合在柱子上的蛋白质， 可用自由配体的溶液洗脱下来，或通过改变溶液的pH、离子强度，或采用 一些弱的变性 试剂 减弱其结合，或采用某种更强的结合物质与其竞争，使其 从柱中分离出来，达到纯化的目的。
3、固相载体介质一般用作凝胶过滤的介质，大都适用于亲和层析的 介质。它们具有稳定的物理和化学性质，具有均匀、多孔的网状结构，允许 大分子物质自由通过，流动性好，非特异性吸附少。这些固相载体首先要用 化学方法进行活化，使其具备与特定的配体相结合的化学活性基团。最常用 的活化方法是用溴化氰（CNBr）活化琼脂糖，目前已有商品出售。