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1. 样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。2. 加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。3. 反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2~1 ug 模板DNA时，应将体积控制在20~30 ul 内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10，因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10，则反应液中甘油浓度将大于5%，而此浓度将抑制内切酶活性。4. 为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA

操作方法所属实验：DNA 片断的酶切实验

利用PCR引物点突变

1. 制备模板（见基本方案，步骤1和2） 2. 合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。 3. 扩增模板DNA（基本方案，步骤4和5），在最后一次延伸结束后，加5 U 的klenow酶，30℃保温15 min。4. 分析并处理反应产物（基本方案1，步骤6和7）。5. 取所得扩增片段的一半量用侧翼序列内的限制性内切酶切割，低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化酶切片段。 6. 将两个扩增的片段通过平末端连接亚克隆入合适的载体。7. 按基本方案1，步骤10、11进行。

操作方法所属实验：定点诱变实验

问假如 模板DNA中混有杂蛋白是不是就扩增不出来

我是金博士

你的DNA模版是怎么提取的呢？有没有进行过处理？扩增没成功，有很原因，杂蛋白的影响也要看情况，一般试剂盒都能去掉的。

实验问答1 回答1710 围观

问pcr中，实验目的对模板dna有倾向吗

unquiet

是实验目的需要什么样的片段，片段的获取决定需要的模板

实验问答3 回答381 围观

Northern杂交实验指导之四：模板DNA制备

相关专题 Northern Blotting技术专题 A.质粒 DNA的小量提取试剂及其配制含AP的LB液体培养基 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 1mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10mmol/L EDTA 50mmol/L 葡萄

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Northern杂交实验指导之四：模板DNA制备

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基本方案

1. 制备模板DNA，如DNA不是经氯化铯梯度纯化的，100℃煮沸10 min 以灭活核酸酶。 2. 制备寡核苷酸引物，若PCR产物要进行平端克隆，就应该对引物的5'端羟基进行磷酸化处理。图一、用PCR反应引入单一的酶切微点和产生符合读码框架的融合蛋白。 3. 建立标准的扩增反应，以矿物油覆盖表面，在以下条件下进行20~25轮扩增循环：94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min，最后一个循环在72℃延伸10 min 尽可能使扩增产物完整。图二、序贯PCR法构建

操作方法所属实验：聚合酶链反应构建重组 DNA

双重PCR毛细管电泳法

1.总DNA提取用CTAB法提取植物总DNA.2.PCR体系及反应条件双重PCR反应体系：1×buffer,2.5mmol/L MgC12,0.25mmol/L dNTP,primers（0.4 μmol/L ZY1-35S,ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS,ZY4-NOS），1.5units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA100——200ng,总反应体积25μ1.PCR循环参数：95℃预变性3min;95℃ 45s,55℃ 60

操作方法所属实验：双重 PCR- 毛细管电泳法检测大豆转基因

问想问一下大家 PCR扩增时 模板DNA是不是不能反复冻融那我该怎么用呢

我是金博士

有两个办法：1、分开装，每个管装一小部分；每次用就取一管，这是最好的。2、可以放4度冰箱的，但是注意冻融一两次以后就不要再用了。

实验问答1 回答2250 围观

问克隆较长片段的基因组DNA的时候，怎么检测模板DNA是否合格？提DNA的时候有什么需要注意的地方？用什么方法提？

Amor良

用紫外分光光度计测od值a260/a280正常1.8左右如果制备的dna样品a260/a280a260/a280>2，说明样品中rna过高，可用rnase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀dna

实验问答4 回答583 围观

Northern杂交试验指导手册－模板DNA的制备

A．质粒DNA的小量提取试剂及其配制含AP的LB液体培养基 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 1mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10mmol/L EDTA 50mmol/L 葡萄糖高压灭菌15min.后，4℃贮存。溶液II: 0.2mol/L NaOH 1% SDS（临用前现配制）溶液III（100ml）：5mol/L

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Northern杂交试验指导手册－模板DNA的制备

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PCR技术原理、实验步骤和应用

重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链

操作方法所属实验：PCR 技术

随即寡核苷酸引物合成法

1. 在1. 5 ml 离心管中加入500 ng~2 μg 模板DNA，加水至总体积为34 μl。 2. 在沸水中变性DNA 5 min 置于冰浴5 min，稍加旋离。3. 按顺序加入下列溶液：（1）10 μl 生物素酰化随即多聚体（2）5 μl dNTP/生物素混合物（3）1 μl klenow酶（5U）（4）37℃温育1 h。 4. 加入3 μl 0.5 mol/l EDTA pH8.0以终止反应。加入5 μl 4 mol/l LiCl和150 μl 冰冷的无水乙醇，置于冰浴

操作方法所属实验：生物素酰化探针的制备实验

问做某个细菌绝对定量需要找到这个细菌引物，然后通过模板DNA扩增成目的片段，然后再将目的片段导入到质粒中，再稀释成标准品。是这样吗

秋秋欣欣

是这样的，做细菌的定量，需要先找到目的片段的引物然后扩增

实验问答5 回答226 围观

问配体外转录体系时模板加入时机

loveliufudan

在配体外转录体系中，模板DNA通常需要在反应缓冲液中进行反应。如果模板DNA在反应缓冲液之前加入，会对转录反应的结果产生一些不利的影响，如：形成DNA结构：模板DNA在缓冲液中可以被完全溶解，并处于单链线性的状态，这是进行转录反应的必要条件。如果模板DNA在缓冲液之前加入，可能会形成复杂的结构，如二级结构或聚集体，从而阻碍RNA聚合酶的结合和转录反应的进行。降低转录效率：如果模板DNA在反应缓冲液之前加入，可能会导致RNA聚合酶在反应中被过度稀释，从而降低反应的效率和产量。因此，为了确保转录

实验问答3 回答320 围观

骨、牙组织模板DNA提取――Glass milk改良法

1 主要配制试剂 1）0.5M Na2EDTA PH8.02) Proeinase K(20 μg/μl)3)6M GuSCN 10mlGuSCN 7.2g加D·W至10ml水浴60℃～65℃溶解4）二氧化硅悬浮液（Silica susponsion、用前混匀） Silica 12g加D、W至100l ↓ 充分混匀置于100ml量筒内室温沉降24小时 ↓ 取上层溶液85ml加D、W至100ml，置于100ml量筒内充分混匀室沉降5小时

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骨、牙组织模板DNA提取实验方法优化

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DNA定点突变实验

一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。二、反应1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。 2. 反应体系：（1）10x pyrobest Buffer： 5 ul （2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul （3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul （4）primer 1 (125 ng) ：1 ul （5）primer 2 (125 ng) ：1 ul

操作方法所属实验：DNA 定点突变实验

RAPD分析技术

一、试验条件 1. 药品试剂（1）模板DNA（10～100 ng）（2）寡核苷酸引物（20 mmol/L贮存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买，也可以自己合成）（3）0.2 mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）（4）Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut）

操作方法所属实验：RAPD（随机扩增多态性DNA）分析技术