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基本方案

相关实验:聚合酶链反应构建重组 DNA

最新修订时间:

原理

利用聚合酶链式反应(PCR),任何两个DNA片段可连接成一个新的重组DNA分子。通过在PCR引物中引入的额外非同源的核苷酸,可在连接处产生所需要的读码框架或酶切位点。

材料与仪器

DNA
TE 无水乙醇 DNA聚合酶 CTP
电泳仪 离心机 PCR仪

步骤

1.  制备模板DNA,如DNA不是经氯化铯梯度纯化的,100℃煮沸10 min 以灭活核酸酶。
 
2.  制备寡核苷酸引物,若PCR产物要进行平端克隆,就应该对引物的5'端羟基进行磷酸化处理。
 

图一、用PCR反应引入单一的酶切微点和产生符合读码框架的融合蛋白。
 
3.  建立标准的扩增反应,以矿物油覆盖表面,在以下条件下进行20~25轮扩增循环:94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸3 min,最后一个循环在72℃延伸10 min 尽可能使扩增产物完整。
 

图二、序贯PCR法构建重组DNA分子,引物1b与基因2同源区域;引物1c有与基因1同源区域
 
4.  取少量反应混合物(4~8 ul),用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。
 
5.  吸去矿物油上层,用氯仿抽提1次除去残存的矿物油,用饱和酚抽提1次,然后用无水乙醇沉淀DNA。
 

图三、用反向PCR插入酶切位点
 
6.  4℃高速离心10 min,沉淀用20 ul TE缓冲液溶解。

7.  用玻璃珠,电冼脱或低融点胶的酚抽法进一步纯化PCR产物可去除未掺入dNTP引物、无关的PCR产物和模板DNA。
 
8.  对于通过平端连接进行的克隆:用DNA聚合酶I (或klenow酶)修平扩增片段的3'末端。
 
9.  对于通过粘端连接进行的克隆:在20 ul 体积用合适的酶消化一半PCR只产物,用过量的酶消化数小时。
 
10.  用合适的末端互补的酶在20 ul 体积内消化0.2~2 ug 载体DNA,用CIP去瞵酸化,以阻止载体自连。

11.  用普通琼脂糖或低融点琼脂溏电泳分离线性化的载体。

12.  用玻璃珠、电洗脱、或酚抽法回收线状的载体。

13.  连接PCR片段和线状载体。
 
14.  取部分连接产物转化大杨杆菌,从转化体集中以小量制备法提取质粒DNA。

15.  用合适的酶消化转化体的质粒DNA,以琼脂糖凝胶电泳分析以确证片段的插人。

16.  测定质粒DNA中扩增片段的序列,检查有无突变,或者用生物化学或遗传学方面的功能分祈筛选转化体。

注意事项

1. 如果出现非特异性带,则可能:


(1)引物设计不合理,出现发夹结构或二聚体;


(2)退火温度不合适;


(3)聚合酶质量不好;


(4)有污染;


(5)引物不纯或过量;


(6)模板过量。

常见问题

随着科学技术的不断发展,在传统PCR技术的基础上发展了包括逆转录PCR,实时定量PCR等新技术,以及多重PCR、DNAshuffing,PCR芯片,固相PCR等改良技术。目前有运用恒温快速扩增技术作为DNA甲基化特异性检测方法来验证癌症的基因,为医学领域的深入探究提供新方法新思路。

文献:廖萍,刘茶珍,重组酶介导扩增技术与传统聚合酶链反应技术在甲状腺癌DNA甲基化检测中的应用对比,中国医药,2003,8(6):797-799

来源:丁香实验

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