Northern杂交试验指导手册－模板DNA的制备

A．质粒DNA的小量提取

试剂及其配制

含AP的LB液体培养基
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)
1mmol/L EDTA (pH 8.0)
溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)
10mmol/L EDTA
50mmol/L 葡萄糖
高压灭菌15min.后，4℃贮存。
溶液II: 0.2mol/L NaOH
1% SDS（临用前现配制）
溶液III（100ml）：5mol/L 乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
dH2O 28.5ml
4℃贮存。
酚∶氯仿（1∶1）
95%和70%乙醇

试验程序

1．在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中，37℃下振荡培养过夜。
2．取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
3．将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次（切勿振荡），再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。
4．在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。
5．加入等量酚∶氯仿（1∶1），振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。
6．加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。
7．用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE重新溶解质粒DNA，取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。

B． 质粒DNA的线性化

试剂及其配制

Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液
酚∶氯仿（1∶1）
3mol/L NaAc(pH 5.2)
100%和70% 乙醇
DEPC-H2O

试验程序

1．在离心管中依次加入：质粒DNA 10μl (1μg/μl)
10×内切酶缓冲液 10μl
dH2O 80μl
Sal I或Not I 2μl(10U/μl)
2．37℃保温反应2小时以上。
3．消化液用100μl的酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min.
4．将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。
5．4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。
6．线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。