Northern杂交试验指导手册－Northern 印迹杂交

A． 探针准备

DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。

B. 印迹条件

对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。

C. 试剂及其配制
MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝
甲酰胺（去离子）
70%乙醇
SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)
用1mol/L HCl调整至pH 7.0
Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)
用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml
于-20℃保存。
预杂交溶液：5× SSC
5× Denhardt 溶液
50%(w/v) 甲酰胺
1%(w/v) SDS
100μg/ml 鲑鱼精DNA（用前加热变性后加入）
杂交溶液：DIG-RNA探针用预杂交液稀释成适当浓度
2×洗膜缓冲液：2×SSC 加入0.1% SDS
0.5×洗膜缓冲液：0.5× SSC加入0.1% SDS
0.1×洗膜缓冲液：0.1× SSC加入0.1% SDS

D. Northern转膜

转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳参照RNA分离中的电泳方法，根据需要选用适当的 分子量Marker.

1．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
2．构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。
3．用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
4．剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。
5．取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。
在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。
6．拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
7．取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。
8．交联：方法1. 将膜夹于两张滤纸之间，在80℃真空烘烤0.5～2小时；方法2. 将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5 J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。
9．转膜效果检测：如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡5～10min.。可见明显的5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。

E．杂交

建议杂交条件：探针浓度50~100ng/ml，温度68℃过夜。
1．将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每100cm2膜20ml预杂交液），封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。
2．将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性，立即使用)，用预杂交液稀释成设定浓度。
3．将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的杂交液，在设定杂交温度条件下（68℃）杂交过夜。
4．杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中，贮存于-70℃以备重复使用。重复使用时，解冻并在68℃下变性10min.。
5．洗膜：杂交膜取出后用2×洗膜缓冲液室温下洗膜2次，每次15min.，除去非结合探针以减少背景。接下来用0.5×洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.，洗膜温度42℃，然后再在0.1×洗膜缓冲液中洗膜2次，每次15min.，洗膜温度68℃。当探针长度小于100bp时，最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。