膜印记杂交法（固相杂交-Northern 印迹杂交法）

Northern 印迹杂交（Northern blotting）是通过凝胶电泳使完全变性的 RNA 按大小分离，然后利用印迹技术将 RNA 分子转移到固相支持物上，固定后再采用特异性的探针进行杂交来鉴定其中特定 mRNA 分子的量与大小。Northern 印迹杂交除了在样品的制备与凝胶电泳分离样品及胶的处理步骤与 Southern 印迹杂交不同外，其他步骤与 Southern 印迹杂交基本一致。采用电泳分离 mRNA 的方法有 3 种，即聚乙二醛和二甲亚砜变性胶电泳、甲醛变性胶电泳和甲基氢氧化汞电泳。

原理

Northern 印迹杂交的基本原理是通过凝胶电泳使完全变性的 RNA 按大小分离，然后利用印迹技术将 RNA 分子转移到固相支持物上，固定后再采用特异性的探针进行杂交来鉴定其中特定 mRNA 分子的量与大小。

仪器：

（一）制备凝胶

称取 0.3g 琼脂糖加入到 30ml 1xMOPS 缓冲液［0.02mol／L MOPS（pH 7.0），8mmol／L NaAc，Immol／L EDTA（pH 8.0）］中，微波炉中加热使琼脂糖熔解后，冷却至 60℃，再加入 1.62ml 甲醛，然后灌胶。让凝胶静置冷却凝固 10～15 分钟后，取出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入 1xMOPS 缓冲液没过凝胶。

取 10～15μg 总 RNA 或 1～2μg mRNA，将它们溶解于样品缓冲液（50％甲酰胺、2.5mol／L甲醛和 1xMOPS凝胶缓冲液）中，60℃ 加热 5 分钟使 RNA 变性，然后迅速置于冰水浴中，加入适量的上样缓冲液［50％蔗糖、10mmol／L磷酸钠（pH 7.0）、0.25％ 溴酚蓝、0.25％ 二甲苯氰（蓝）］混匀。

印迹转移前切下含分子量标记物泳道的凝胶，EB染色后，于紫外灯下放一根尺子拍照，记下分子量标记的片段位置，以便杂交后确定杂交带的分子量大小。在真核细胞中富含两种 RNA，即 28SrRNA（4718nt）和 18S rRNA（1874nt），它们不仅可以用作分子量的标记，同时也是 RNA 是否发生降解的一个指标。质量较好的RNA样品在变性琼脂糖凝胶中，于紫外灯下观察应该清晰可见，而且 28SrRNA 的含量应该明显高于 18S rRNA（通常约为 2 倍）。

1．保持 RNA 的稳定。由于 RNA 非常不稳定，极易降解，因此首先要创造一个无 RNA 酶的环境。在杂交过程中RNA接触到的所有容器、试剂均要进行处理，淬灭其中的 RNA 酶。整个操作过程应该与其他可能含 RNA 酶的操作分开，而且操作时最好戴上一次性手套和口罩，因为人体各种来源的污染物中含有丰富的 RNA 酶。

2．如果没有杂交信号或信号弱，则需要从 RNA 样品的制备及转移、探针片段的选择及标记、杂交及洗膜的条件选择、标记物的示踪反应等方面进行综合性分析。一些 Southern 印迹杂交过程中影响结果的因素同样是 Northern 印迹杂交过程中要考虑的因素。

3．除硝酸纤维素膜外，尼龙膜也基本适用于毛细管法的 RNA 转移。使用尼龙膜时，印迹前应用水将含甲醛凝胶中的甲醛冲洗掉。另外，尼龙膜可在碱性条件下与 RNA 结合，因此也可用 7.5mmol/L NaOH 作为转移液。碱性条件下 RNA 不可逆地与尼龙膜结合，因此，RNA转移到尼龙膜后不须经烘烤或用紫外线照射固定。碱性转移后，尼龙膜只需用 2xSSC及0.1％SDS 漂洗，然后置室温干燥即可。