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核酸分子固相杂交实验

实验分类:

DNA 实验

最新修订时间:

简介

核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。核酸分子杂交依据被分析样品的性质不同可以分为液相杂交与固相杂交两种。固相杂交是将参加反应的一条核酸单链先固定在固体支持物上,另一条互补核酸单链游离在溶液中,两者在一定的条件下进行杂交反应。固体支持物有硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交常见的种类有细胞原位杂交和膜印迹杂交等。细胞内核酸可以直接进行细胞原位杂交;亦可以从细胞中分离纯化后转移至载体膜上与相应探针进行膜印迹杂交,此类杂交包括 Southerm 印迹杂交、Northern 印迹杂交、斑点/狭缝印迹杂交等。


原理

核酸分子杂交的基本原理是两条互补核酸单链 DNA  RNA 在一定条件下(适宜的温度及离子强度)可按碱基互补配对的原则退火形成双链分子(DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA),由此可检测核酸分子的存在与否。杂交的双方是待测的核酸序列及探针,杂交后形成的异质双链分子称为杂交分子或杂交双链。由于杂交是在分子水平上进行的,故称为分子杂交。


应用

由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性,使得它在分子生物学领域中被广泛应用,可应用于包括基因克隆的筛选和酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定量和定性分析、基因突变分析以及疾病的诊断等。


来源:《医学分子生物学实验技术》药立波第3版第6章

操作方法

膜印记固相杂交法(固相杂交-Southern 印迹杂交)

DNA 的印迹杂交,又称 Southern 印迹杂交(Southern blotting),是指将通过凝胶电泳分离的DNA片段转移到特定的固相支持物上,在转移过程中 DNA 分子保持其原来的相对位置不变,然后采用标记的核酸探针与结合于固相支持物上的 DNA 分子进行杂交的技术。由于探针与待测核酸片段中的互补序列形成杂交分子,探针分子显示的位置及量的多少,将反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因以及

膜印记杂交法(固相杂交-Northern 印迹杂交法)

Northern 印迹杂交(Northern blotting)是通过凝胶电泳使完全变性的 RNA 按大小分离,然后利用印迹技术将 RNA 分子转移到固相支持物上,固定后再采用特异性的探针进行杂交来鉴定其中特定 mRNA 分子的量与大小。Northern 印迹杂交除了在样品的制备与凝胶电泳分离样品及胶的处理步骤与 Southern 印迹杂交不同外,其他步骤与 Southern 印迹杂交基本一致。采

膜印记杂交法(固相杂交-斑点/狭缝印迹杂交法)

斑点印迹杂交法(dot blotting)是将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探针进行杂交;狭缝印记杂交(slot blotting)采用狭缝点样器加样后杂交,二者的区别主要是点样的形状不同。原理斑点/狭缝印迹杂交法的基本原理是将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探针进行杂交。用途斑点/狭缝印迹杂交法常用于基因表达的

细胞原位杂交法(固相杂交-菌落/噬菌斑原位杂交)

菌落/噬菌斑原位杂交是一种在硝酸纤维素滤膜上原位裂解细菌菌落并将释放出来的 DNA 非共价结合于滤膜的方法。结合于滤膜上的 DNA 再与相应的放射性标记核酸探针杂交,根据杂交结果筛选含有目的 DNA 序列质粒的细菌菌落。菌落的原位杂交技术主要用于基因克隆以及基因文库的筛选,以期从大量细菌克隆中分离含有目的基因片段的阳性克隆。原理核酸原位杂交(nucleic acid hybridization i

细胞原位杂交法(固相杂交-荧光原位杂交法)

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)中的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用核素标记的放射性探针的优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间加强信号强度;缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高及核素操作较繁琐等。采用荧光标记系统即FISH技术可以克服以上不足。FISH 技术作为非放射性检测体系

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