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膜印记杂交法(固相杂交-斑点/狭缝印迹杂交法)

相关实验:核酸分子固相杂交实验

最新修订时间:

简介

斑点印迹杂交法(dot blotting)是将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探针进行杂交;狭缝印记杂交(slot blotting)采用狭缝点样器加样后杂交,二者的区别主要是点样的形状不同。


原理

斑点/狭缝印迹杂交法的基本原理是将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探针进行杂交。


用途

斑点/狭缝印迹杂交法常用于基因表达的定性及定量分析,是实验室中的常用技术。


材料与仪器

试剂:
去离子甲酰胺 甲醛(37%) 20XSSC NaOH 预杂交液
仪器:
狭槽 点样器 真空泵 可烫封塑料袋或杂交管 硝酸纤维 K 膜或尼龙膜 Whatman3MJV1 滤纸


步骤

斑点/狭缝印迹杂交法的基本过程可分为如下几步:
(一)样品处理
l0ulRNA10ug,(RNA可多至50ug)水溶液与下述溶液混合:
100%甲酰胺 20ul、甲醛(37%) 7ul、20XSSC 2ul

60℃ 温育 15min 使其变性,冰浴冷却样品。


(二)点样

0.lmol/LNaOH 清洗点样器,再用 DEPC 水充分冲洗。将一张经 20XSSC 浸润的 Whatman 3MM 滤纸铺在点样器上,上面铺张经 20XSSC 浸润 30min 的硝酸纤维素膜,加盖并夹紧,接通真空泵。用 10XSSC 清洗各样孔。在每一 RNA 样品中加 2 倍体积的 20XSSC,混合后加样。于外围几个孔中加染料定位,缓慢抽吸,毎孔用 lml10XSSC 淸洗2次。继续抽吸 5min,吸干滤膜。


(三)固定

取出滤膜,室温晾干后,夹在 2 张 Whatman 3MM 滤纸中间,80℃ 干烤 2h 以固定 RNA


(四)预杂交

滤膜烘干后放入可烫封塑料袋(或杂交管)中,加入 20〜30ml 预杂交液,密封塑料袋后在 42°C 预杂交 3h


(五)探针制备及标记


(六)杂交

将已标记的探针煮沸变性 l0min,取出后立即置冰浴 10min(单链探针不需要变性),将变性探针加入预杂交液中,密封杂交塑料袋后在 42℃ 杂交过夜。


(七)洗膜
杂交结束后,分別用下列洗液洗膜:
1)2XSSC0.5%SDS,室温洗膜 5min。

2)1XSSC0.1%SDS42℃ 洗膜 30min。0.1XSSC,0.5%SDS,56℃ 洗膜 30min。


(八)检测
X 射线片进行放射性自显影,附加增感屏,-70°C 曝光 7-10 天。


注意事项

1、使用快速制备法获得的细胞总 RNA 有可能污染基因组 DNA,因此难以用分光光度计来精确测定 RNA 含量。此外还必须防止上样矫作物的出现。对半定最分析来说,每一样品须做两次狭缝印迹,一张膜与所要检测的 RNA 探针杂交,另一张则与另-种 RNA 探针杂交,这种在各个样品中的表达都应一样,或者也可以对一个样品制作-次印迹,但同一张膜必须进行两次重复杂交。


2、RNA 样品在点样时要稀释 8 倍,因此样品的浓度至少为 10mg/mL


3、狭缝杂交很容易出现假阳性性信号。这可通过以下手段尽可能的避免:

①用 Northern 印迹方法严格鉴定探针的特异性;

②在所用测试中均需要有适当的阴性对照;

③须非常细心地制备所用探针、溶液、RNA 等以避免污染。


来源:丁香实验

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