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固相膜核酸分子杂交方法

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  1.DNA的变性 DNA变性解链是杂交成功的关键。Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用数倍体积的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性,但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好,可避免DNA降解。热变性在要低DNA浓度(100μg/ml)和低盐浓度(0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L柠檬酸三钠,pH7.0)下进行。用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml,加10mol/l NaOH使最终浓度为0.1mol/L(pH约12.8),室温变性10min,很快置冰盐水中,用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4调pH到7~8[亦可用碱变性后,调至中性,再加热100。c 10min],DNA变怀可用OD260增加(约30%~40%)来检测,变性DNA醇沉淀呈雪样,完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的12×SSC,冰浴保存。

  2.变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定 硝酸纤维素滤膜(孔径0.45μm)先在蒸馏水中充分浸泡,再用6×SSC浸泡30min~2h,凉干。DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后,先室温干燥4h,然后在80。C真空干燥2h。

  3.预杂交 湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中,按每平方厘米滤膜加0.2ml预热至60。C的预杂交液(6×SSC,0.5%,SDS,5×Denhardt液,100μg/ml鲑鱼精DNA)。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理,然后酒精沉淀纯化,调浓度至10mg/ml,用前放100。C水浴中煮沸变性10min,冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽,可封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68。C水浴保温3~12h。当预杂交液温度升至68。C时,在滤膜表面常会形成小气泡。轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡,这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。

  4.杂交 从水浴中取出塑料袋,用剪刀剪开一角,尽可能挤净预杂交液。用吸管或大枪头将杂交液加入袋中,用恰好是足量的液体保持滤膜湿润(50μl/cm2)。溶液的组成是6×SSC,0.01mol/l EDTA, 变性的标记核酸探针,5×Denhardt液,0.5%SDS, 100μg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后,将塑料袋严密封口,杂交反应在68℃水浴中进行,所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定,一般4~20h。

  5.洗膜 取出塑料袋,用剪刀剪开,小心取出滤膜,立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盘中,室温下漂洗5min。再将滤膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中,室温下洗涤15min(轻轻摇动)。然后将滤膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中;68℃轻轻摇动保温2h,更换缓冲液后继续保温30min。

  洗膜的温度一般应控制在低于Tm值12℃以上。(Tm = 69.3 0.41x(G C) %)。双链DNA的Tm值随错配碱基对数每增加1%而递减1℃。

  6.结果显示 固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式,一是放射性自显影法,另一种是液闪计数法。前一种方法比较简单,只需将杂交膜与X光片在暗盒中曝光数小时至数天,再显影、定影即可。对于杂交信号较弱的固相膜,用一块增感屏可显著增强曝光强度。此外,为了减弱32P的散射,曝光通常在-20℃或-80℃下进行。液闪计数法主要用于打点和狭缝杂交及为了比较两个杂交信号的强弱等情形。方法是将完成杂交的膜在漂洗结束后剪成小块(每份样品1块),80℃真空干燥后装闪烁瓶。加入2~5ml闪烁液,剪2~3块无样品膜块作为本底对照。在液体闪烁计数器上自动计数。液体计数测定放射性强度也可在放射自显影之后进行。

 

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