Northern印迹杂交

　　Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。

DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western blot。

Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团。

RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱。

在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。样品胶则进行Northern转印，标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L 醋酸铵中10min，在水中就可脱色。

在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。

从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mR－NA时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

下面介绍RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法：

（1）试剂

　　10×MSE缓冲液：0.2mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0, 50mmol/L 醋酸钠，1mmol/l EDTA, pH8.0。

　　5×样品缓冲液：50%甘油，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚蓝。

　　甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L）。应在通风柜中操作，pH高于4.0

　　去离子甲酰胺。

　　50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)。

　　0.1mol/L Tris·HCl,Ph7.5。

（2）步骤

　　①40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml 10×MSE缓冲液、11.5ml甲醛，加水定容 至70ml，混匀后 倒入盛胶槽。

　　②等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。

　　③使RNA变性（最多20μg）：RNa 4.5μl，10×MSE缓冲液2.0μl，甲醛3.5μl，去离子甲酰胺10.0μl。

　　④55℃加热15min，冰浴冷却。

　　⑤加2μl 5×载样缓冲液。

　　⑥上样，同时加RNA标记物。

　　⑦60伏电泳过夜。

　　⑧取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。

　　⑨室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。

　　⑩室温下将胶浸到0.1mol/L Tris·HCl (Ph7.5)中45min，使胶中和。

　　⑾20×SSC洗胶1h。

　　⑿20×SSC中过夜，转印到硝酸纤维素膜上。

　　⒀取出硝酸纤维膜，80℃真空烘烤2h。