骨、牙组织模板DNA提取――Glass milk改良法
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1 主要配制试剂
1)0.5M Na2EDTA PH8.0
2) Proeinase K(20 μg/μl)
3)6M GuSCN 10ml
GuSCN 7.2g
加D·W至10ml
水浴60℃~65℃溶解
4) 二氧化硅悬浮液(Silica susponsion、用前混匀)
Silica 12g加D、W至100l
↓
充分混匀置于100ml量筒内室温沉降24小时
↓
取上层溶液85ml加D、W至100ml,置于100ml量筒内充分混匀室沉降5小时
↓
取上层溶液85ml加12μl 10M HCL、充分混匀
分装、高压灭菌(121℃ 20min)备用。
5) 70%乙醇(-20℃)
6)丙酮(-20℃)
7)Nuclease free H2O
2 主要仪器
旋转混摇器(rotator)
电泳仪
紫外分析仪
调速摇床(Rocker Platform)
Shimadzu UV-250型紫外分光光度计
3 操作步骤
3.1 样本准备
1)骨:骨高压灭菌细沙纸磨去骨表面0.5mm厚层,254nm紫外线照射1小时以防外源性DNA污染;然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟,取出干燥。将骨片放入盛有液氮搪瓷碗内用小型手电钻钻取骨粉备用。
2)牙:254nm紫外线照射1小时,然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟,干燥后在液氮中冷冻24小时。用高压灭菌的密度白布包裹,榔头敲击成细粉沫备用。
3.2 骨、牙组织DNA分离和纯化
1)流程图
样本 DNA提取buffer消化
↓
二氧化硅结合DNA
↓
70%乙醇、丙酮洗涤硅珠
↓
56℃洗提DNA
↓
去除二氧化硅
↓
转移DNA溶液
↓
-20℃保存备用
2)操作
①取骨粉0.25g(牙粉沫0.1g)置于1.5Eppendorf管,加1.0ml 0.5M Na2EDTA(PH8.0),25μl proteinase K(20μg/μl)。将Eppendorf管置于旋转混摇器上,室温混摇24小时。
②将样品Eppendorf管置于56℃干热器上继续消化2小时。
③离心13000rpm,5分钟。
④取上清液700μl移至另一洁净1.5ml Eppendorf管中(弃沉渣),加700μl 6M GuSCN,20⑤μl二氧化硅悬浮液置于旋转混摇器上,室温混摇2小时。
⑤离心13000rpm,20秒,充上清液保留硅珠。
⑥用-20℃ 70%乙醇洗涤硅珠两次,每次离心13000rpm,20秒。
⑦用-20℃丙酮洗涤一次,离心13000rpm,20秒。
⑧样品Eppendorpf管置于56℃干热器上,15分钟洗提DNA,每5分钟振摇一次。
⑨离心13000rpm 2分钟,将60μl DNA溶液移至0.5ml Eppendorf中,置于-20℃保存备用。
3.3 DNA定量
3.3.1 凝胶定量
1)配制1%琼脂糖凝胶:将2g琼脂糖加入200ml 1×TBE缓冲液中,煮沸溶化,待冷却至60℃加入10μlEB,充分混匀。
2)将琼脂糖溶化液灌入制胶模具,放置30分钟,使其冷却固化。
3)小心取出加样硫,将已制好凝胶放入电永槽,加1×TBE缓冲液使其高出胶面约1cm。
4)将标准含量(30μg/ml、20ng/ml、10ng/ml、50μg/ml)DNA样品,标准DNA分子量Marker和可见性DNA参照置于干热器孵育5分钟,稍离心。
5)将可见性DNA参照物及用作下量尺度的标准量DNA各10μl及待测DNA样品按从左向右依次加入胶中,两侧加标准DNA分子量Marker。
6)150v电压电泳30分钟。
7)紫外分析仪上观察结果并照像,与标准品对照推算样本DNA含量。
3.3.2 紫外分光光度计法
采用Shimadzu UV-250型紫外可见分光光度计测定DNA浓度,仪器预热10分钟,用1.0ml去离子水校正零点,吸取10μl DNA样品加990μl去离子水混匀,转入石英比色杯中。在260nm,280nm和320nm处读出光密度。
依据公式DNA样品浓度=A260×核酸稀释倍数×50‰;提取DNA溶液中蛋白含量=1.55×(A280 -A320 )-0.76×(A260 -A320 )进行计算,核酸纯度由A260/A280的比率进行估计。
4 注意事项
1.本技术标准运用于自然条件下保存6~60年骨。
2.不同处理保存状况对骨组织DNA稳定性影响不同(如加碱水煮,火烧等),骨组织DNA骨减少。
3.本技术采用高压灭菌细砂纸磨去骨表面0.5mm厚层,254nm紫外线照射1小时消除外源性DNA污染。