材料与仪器
DNA
DNA聚合酶 klenow 限制性内切酶
水浴锅 离心机 培养箱
DNA聚合酶 klenow 限制性内切酶
水浴锅 离心机 培养箱
步骤
1. 制备模板（见基本方案，步骤1和2）
2. 合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。
3. 扩增模板DNA（基本方案，步骤4和5），在最后一次延伸结束后，加5 U 的klenow酶，30℃保温15 min。
4. 分析并处理反应产物（基本方案1，步骤6和7）。
5. 取所得扩增片段的一半量用侧翼序列内的限制性内切酶切割，低熔点琼脂糖凝胶电泳 纯化酶切片段。
6. 将两个扩增的片段通过平末端连接亚克隆入合适的载体。
7. 按基本方案1，步骤10、11进行。
7. 按基本方案1，步骤10、11进行。
常见问题
来源：丁香实验
