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PCR之引物详解

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11906

1. 引物是如何合成的?

  目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 DNA 合成仪有很多种 , 主要都是由 ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
  亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的,合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的,相邻的核苷酸通过 3'→5' 磷酸二酯键连接。
  第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其 5'- 羟基的保护基团 DMT ,获得游离的 5'- 羟基;
  第二步,合成 DNA 的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的 3' 端被活化, 5'- 羟基仍然被 DMT 保护,与溶液中游离的 5'- 羟基发生缩合反应。
  第三步,带帽 (capping) 反应,缩合反应中可能有极少数 5'- 羟基没有参加反应 ( 少于 2%) ,用乙酸酐和 1- 甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。
  第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
  经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5'- 羟基上的保护基团 DMT ,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。
  通过氨水高温处理,连接在 CPG 上的引物被切下来,通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物,成品引物用 C18 浓缩 , 脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定 OD260 定量,根据定单要求分装。

2. 引物纯化方式有哪些,如何选择?
  ◆ C18 柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对 DNA 有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通 PCR 反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。     
  ◆ OPC 纯化: OPC 纯化是根据 DNA 保护基( DMTr 基)和 Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA 片段。 OPC 法纯化的 DNA 纯度大于 95% 。适用于 40mer 以下引物的纯化。
  ◆ PAGE 纯: PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对 DNA 片段进行分离,然后从凝胶中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 纯化法也是一种非常有效的 DNA 纯化方法,纯化后的 DNA 纯度大于 95% ,对长链 Oligo DNA ( 大于 50mer) 的纯化特别有效。  
  ◆ HPLC 纯化: HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理,对 DNA 片段进行纯化。纯度可以大于 99% 。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。  本公司现在 OPC 与 HPLC 两种纯化方式供你选择。 

3. 引物的 OD 数如何定量?
  答:引物合成引物 OD 数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长 260nm ,石英比色杯,光程为 1 厘米 ,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。 DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。

4. 投诉定量不准是怎么回事儿?
  答:我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告,出现这种情况的可能性有( 1 )生产人员定量错误。这种可能性有,但是不大,因为我们的生产人员都是经过严格的培训,程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户 OD 数,因为无论 OD 数是否达到定单要求,我们都统计为工作量,没有达到 OD 数的,分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下,引物都有留样。接到用户投诉后,我们都会找出留样重新定量,一般都没有问题。(2)分装没有问题,但引物抽干或收样过程中,引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。( 3 )系统误差,我们认为 10% 左右为允许误差。使用过程中,引物工作浓度范围很宽,定量上的少许偏差不影响实验。( 4 )用户没有能够正确理解引物 OD 数的含义,没有能够正确使用分光光度计,特别是使用微量测定;用户没有将 OD 读数,正确地转换成母液中 OD 数。这种情况比较常见。( 5 )用户收到引物干粉时,打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
  例如,验证标 2OD 引物量是否准确,简单的做法是: 加入 1ml 水,彻底溶解混匀后,取 100ul, 加入 900ul 水,用光径为 1cm 的石英比色杯,波长 260nm, 此时光吸收的读数为 0.2 。

5. 需要什么级别的引物?
  答:引物常用的纯化方式 C18 脱盐, OPC 纯化, PAGE 纯化, HPLC 纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

 

应用

引物长度要求

纯度级别要求

一般 PCR 扩增

< 45base

OPC

 

>45 base

PAGE

诊断 PCR 扩增

< 40base

OPC, PAGE

DNA 测序

20base 左右

OPC

亚克隆,点突变等

根据实验要求定

OPC, PAGE , HPLC

基因构建(全基因合成)

根据实验要求定

PAGE

反义核酸

根据实验要求定

PAGE

修饰引物

根据实验要求定

PAGE, HPLC

(责任编辑:大汉昆仑王)
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