PCR如何有效设计引物?

1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
　　DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

　　2、引物长度一般在15-30碱基之间。
　　引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

　　3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

　　4、引物3'端要避开密码子的第3位。
　　如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

　　5、引物3'端不能选择A，最好选择T。
　　引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。

使用引物设计软件，primer5, primer3，或者从文献里查引物

1、引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计

2、引物长度一般在 15-30 碱基之间

3、引物 GC 含量在 40%~60% 之间，Tm 值最好接近 72℃

4、引物 3' 端要避开密码子的第 3 位

5、引物 3' 端不能选择 A，最好选择 T

6、碱基要随机分布

7、引物自身及引物之间不应存在互补序列

8、引物 5' 端和中间 △G 值应该相对较高，而 3' 端 △G 值较低

9、引物的 5' 端可以修饰，而 3' 端不可修饰

10、扩增产物的单链不能形成二级结构

11、引物应具有特异性

做 Real Time 时，用于 SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

（1）避免重复碱基，尤其是 G。

（2）Tm=58-60 度。

（3）GC=30-80%。

（4）3' 端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C.

（5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

（6）PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80-250bp 之间都可；80-150bp 最为合适（可以延长至 300 bp）。

（7）引物的退火温度要高，一般要在 60 度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

PCR引物设计原则和筛选技巧

PCR-引物设计原则 1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38。