定点诱变实验

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

来源：丁香实验

操作方法

基本方案

1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。 2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓为1 ng/μl。 3. 合成寡核苷酸引物，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化，重悬于500 μl TE缓冲液中，在A260吸光度，调整浓度至500 ng/μl。 4. 往两个500 μl 量离心管加入

利用PCR引物点突变

1. 制备模板（见基本方案，步骤1和2） 2. 合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。 3. 扩增模板DNA（基本方案，步骤4和5），在最后一次延伸结束后，加5 U 的klenow酶，30℃保温15 min。 4. 分析并处理反应产物（基本方案1，步骤6和7）。 5. 取所得扩增片段的一半量用侧翼序列内的限制性内切酶切割，低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化