定点诱变(DpnI法)

1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。

2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。

反应体系：

10x pyrobest Buffer 5 ul
dNTP Mixture(10mM) 1ul
模板DNA(5~50ng) 1ul
primer 1 (125ng) 1ul
primer 2 (125ng) 1ul
pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul
加无菌蒸馏水至 50ul

3、产物沉淀纯化：加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20゜C冰箱）5min,离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）

4、DpnI酶切：Buffer 2ul
BSA（100╳） 0.2ul
DNA x ul
DpnI 0.5ul
加无菌去离子水至 20ul

30゜C酶切 1~4 h ；65゜C 水浴15min 终止反应。

5、将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。

6、测序验证