Northern杂交实验指导之四:模板DNA制备
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A.质粒 DNA的小量提取
试剂及其配制
含AP的LB液体培养基
TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)
1mmol/L EDTA (pH 8.0)
溶液I: 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)
10mmol/L EDTA
50mmol/L 葡萄糖
高压灭菌15min.后,4℃贮存。
溶液II: 0.2mol/L NaOH
1% SDS(临用前现配制)
溶液III(100ml):5mol/L 乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
dH2O 28.5ml
4℃贮存。
酚∶氯仿(1∶1)
95%和70%乙醇
试验程序
1.在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中,然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌 接种其中,37℃下振荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物置于一微量离心管中,在4℃下12000rpm离心2min.,弃去上清液,使细菌沉淀尽可能干燥。
3.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中,剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II,盖紧离心管口,将其快速颠倒5次(切勿振荡),再加入150μl在冰上预冷的溶液III,盖紧离心管口,将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀,再将离心管置于冰上3~5min.。
4.在4℃下12000rpm离心5min.,将上清液移至另一离心管中。
5.加入等量酚∶氯仿(1∶1),振荡混匀,在4℃下12000rpm离心2min.,将上清液转入另一离心管中。
6.加入二倍体积95%乙醇,振荡混匀,室温放置20min.,在4℃下12000rpm离心5min.,小心弃去上清液,倒置将液滴除尽。
7.用70%乙醇洗涤一次,室温干燥10min.,用50μl含20μg/ml胰RNA酶(无DNA酶)的TE重新溶解质粒DNA,取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测,其余置于-20℃保存备用。
B. 质粒DNA的线性化
试剂及其配制
Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液
酚∶氯仿(1∶1)
3mol/L NaAc(pH 5.2)
100%和70% 乙醇
DEPC-H2O
试验程序
1.在离心管中依次加入:质粒DNA 10μl (1μg/μl)
10×内切酶缓冲液 10μl
dH2O 80μl
Sal I或Not I 2μl(10U/μl)
2.37℃保温反应2小时以上。
3.消化液用100μl的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次,每次在在4℃下12000rpm离心5min.
4.将上清液转入一新的离心管中,加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。
5.4℃下12000rpm离心20min.,弃去上清液,沉淀用70%乙醇洗涤一次,真空干燥。
6.线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中,取10μl电泳检测线性化质量,其余于-20℃下保存备用。