材料与仪器
寡核苷酸
LB SDS EDTA TMAC
水浴锅 离心机 培养箱 尼龙膜
LB SDS EDTA TMAC
水浴锅 离心机 培养箱 尼龙膜
步骤
1. 按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交”介绍的方法处理已影印细菌菌落的滤膜。
2. 按下列方法制备带扩增噬斑的滤膜
（1）从文库中以渐减密度〔15 000~8 000噬斑 / 150 mm 平板）的方式将噬菌体铺在琼脂糖平板上。
（2）37 ℃培养至长出可见的噬斑。
（3）将噬斑影印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜后，滤膜移至预热的LB琼脂糖平板上，37℃培 养5~12 h（转印后冷室保存主平板）。
（4）将影印到膜上的噬菌体DNA变性并使之结合到滤膜上。
2. 按下列方法制备带扩增噬斑的滤膜
（1）从文库中以渐减密度〔15 000~8 000噬斑 / 150 mm 平板）的方式将噬菌体铺在琼脂糖平板上。
（2）37 ℃培养至长出可见的噬斑。
（3）将噬斑影印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜后，滤膜移至预热的LB琼脂糖平板上，37℃培 养5~12 h（转印后冷室保存主平板）。
（4）将影印到膜上的噬菌体DNA变性并使之结合到滤膜上。
3. 转印细菌菌落的滤膜按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交”的步骤1洗膜，然后将滤膜浸入50℃ 2×SSC / 0.5%SDS / 50 mmol/l EDTA，pH8.0溶液中洗涤，尽可能冼去滤膜上影印的细菌残渣，然后用同洋的溶液再洗1遍。
4. 按每张滤膜5~10 ml 预温的TMAC杂交液量，在15 cm 玻璃水晶盘中可移入多达30 张的滤膜，用塑料保鲜膜将玻璃盘封好。
5. 在杂交温度下预杂交1 ~2 h。杂交温度和洗膜温度均应比解链温度低5~10℃。
5. 在杂交温度下预杂交1 ~2 h。杂交温度和洗膜温度均应比解链温度低5~10℃。
6. 预杂交后，将滤膜转移到一个装满新鲜、预热的TMAC杂交液的杂交容器中。
7. 并按毎毫升杂交液加入1×106~2×106 cpm35P标记的寡核苷酸探针，于适当的温度下温育40~60 h。
7. 并按毎毫升杂交液加入1×106~2×106 cpm35P标记的寡核苷酸探针，于适当的温度下温育40~60 h。
8. 室温下每张滤膜先用5~10 ml TMAC洗液洗涤，然后分别将滤膜转移到200~ 250 ml 新鲜的TMAC洗液中，轻轻振荡洗涤15 min。
9. 换上等体枳预热的TMAC冼膜液，在适当的洗膜温度下温育1 h。
10. 再用等体积的2×SSC / 0.1%SDS洗膜液在室温下洗膜，共3次，每次约10 min，以去除TMAC。
11. 最后按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交”进行放射自显影。
10. 再用等体积的2×SSC / 0.1%SDS洗膜液在室温下洗膜，共3次，每次约10 min，以去除TMAC。
11. 最后按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交”进行放射自显影。
来源：丁香实验
